浮游菌测试：药品洁净实验室环境微生物监测的关键方法

浮游菌测试是洁净室、无菌检查实验室和无菌生产环境中常用的微生物监测方法。它通过空气采样器主动采集一定体积的空气，使空气中的微生物粒子沉积到培养基表面，再经培养和计数，评价环境空气中可培养微生物的污染水平。

在药品微生物控制中，浮游菌测试的意义不是“证明某批产品无菌”，而是证明洁净环境处于受控状态。它与沉降菌、表面微生物、人员监测、悬浮粒子监测共同构成洁净环境监控体系。无菌检查结果关注供试品是否污染；浮游菌监测关注实验或生产环境是否具备可靠的污染控制能力。

一、浮游菌是什么

浮游菌是指悬浮在空气中的微生物粒子，可能包括细菌、真菌孢子、酵母、皮屑附着菌、尘埃携带菌以及由人员、设备、物料和气流扰动带来的微生物。它们本身通常不是单独漂浮的“裸细胞”，而是附着在尘粒、皮屑、液滴或气溶胶颗粒上。

浮游菌测试反映的是“在规定采样方法和培养条件下，可被采样并形成菌落的空气微生物数量”。因此，结果通常以 CFU/m³ 表示。CFU/m³ 不是空气中全部微生物的真实总数，而是可培养空气微生物污染水平的标准化估计值。

二、浮游菌测试与无菌检查的关系

无菌检查需要在受控环境中进行，避免外源污染造成假阳性。浮游菌测试就是评价该环境是否受控的重要手段之一。《中国药典》9205“药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”明确，药品洁净实验室浮游菌监测应按现行国家标准《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》进行，采样器可选择撞击式采样器或滤膜式采样器等。

二者关系可概括如下：

浮游菌结果异常时，应关注其对当次无菌检查或洁净操作的潜在影响，但不能简单把浮游菌超标直接等同于供试品污染。

三、常用采样原理

浮游菌采样器通常采用主动采样方式，将一定体积空气吸入设备，并使空气中的微生物粒子沉积到培养基表面或被滤膜截留。常见采样器包括撞击式、狭缝式、离心式、筛孔式和滤膜式等。

采样器应定期校准流量和计时系统。流量不准确会直接导致 CFU/m³ 计算错误；采样头灭菌不彻底或残留消毒剂未充分挥发，则可能造成假阳性或假阴性。

四、培养基选择：TSA 为基础，SDA 可补充真菌监测

环境浮游菌、沉降菌和表面微生物监测通常使用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）。《中国药典》9205 指出，环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用 TSA，培养温度为 30～35℃，时间为 3～5 天；必要时可加入适宜中和剂。若监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响，可增加沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA），培养温度为 20～25℃，时间为 5～7 天。

培养基选择要点如下：

如果洁净区使用季铵盐、过氧化氢、过氧乙酸、含氯消毒剂或其他消毒剂，培养基中是否需要加入中和剂，应通过方法确认或现场回收验证判断。中和剂不足会导致微生物被继续抑制，结果偏低；中和剂本身有毒或浓度不当，也可能影响回收率。

五、培养基预培养与包装控制

用于洁净环境监测的平板本身可能成为污染源。多层包装、终端灭菌或无菌包装可以降低将外源微生物带入洁净区的风险。若培养基不能终端灭菌，使用前预培养可以发现污染平板，减少洁净区监测假阳性。

预培养管理应关注：

预培养后仍应避免平板过度干燥。过干的平板可能降低空气微生物回收率，造成结果偏低。

六、采样前准备：设备、人员和残留控制

浮游菌采样前，应确认采样器清洁、消毒、灭菌部件、流量校准和电量或供气状态符合要求。用于高级别洁净区的采样器外表面应按区域要求消毒后传入，采样头、采样盖、采样管路或关键接触部件应经灭菌处理。

采样人员应穿戴与被测区域级别相匹配的洁净服和无菌手套，操作动作应缓慢，避免人员自身扰动成为主要污染源。采样器经消毒后，应避免消毒剂残留直接接触培养基；必要时按经验证方式进行挥发或空转，以防残留消毒剂抑制微生物生长。

采样前应重点确认：

七、采样点布置：风险点比平均布点更重要

浮游菌采样点不应只追求“均匀分布”。洁净环境监测应覆盖关键操作位置、高风险气流位置、人员活动位置、物料传递口、设备周边、无菌检查操作台附近以及历史污染高发点。EU GMP Annex 1 也强调，洁净室和洁净空气设备的确认应包括微生物空气和表面污染等项目，关键处理位置应基于工艺和操作知识通过文件化风险评估确定。

布点应结合以下因素：

采样点一旦确定，应保持相对稳定，便于趋势分析。若设施、设备、人员流向、清洁消毒方式或工艺发生变化，应重新评估监测点位。

八、采样量与计算：注意 L 和 m³ 的换算

浮游菌结果通常按每立方米空气中的菌落形成单位报告。原文公式写作“平均浓度 = 菌落数 / 采样量”，这个表达只有在采样量单位已经换算为 m³ 时才成立。若采样量以 L 表示，应换算为：

CFU/m³ = 菌落数 ÷ 采样体积（L） × 1000

例如采样 1000 L，相当于 1 m³；采样 500 L，相当于 0.5 m³；采样 100 L，相当于 0.1 m³。若直接用菌落数除以 L 数，会低估 1000 倍。

采样量不是越大越好。采样量过小会降低检出概率；采样量过大可能导致培养基表面失水、菌落重叠或气流冲击造成损伤。应按现行标准、洁净级别、仪器说明书和企业监测计划确定。

九、Feller 校正：不是所有菌落数都等于原始撞击数

多孔筛板式撞击采样器存在“多个微生物粒子通过同一孔撞击到同一位置”的可能。此时培养后只形成一个菌落，实际进入采样器的微生物粒子数可能高于可见菌落数。因此，当采样器采用多孔撞击结构时，通常需要根据采样头孔数和阳性孔数进行 Feller 校正，也称正孔校正。

Feller 校正的意义是降低高菌落数时的低估风险。菌落数越接近采样孔数，未校正误差越大。不同型号采样器的校正表或校正公式可能不同，应按仪器说明书或标准要求执行。

需要注意：

报告结果时，应明确是否进行了 Feller 校正，避免同一实验室不同人员使用不同计数逻辑。

十、结果判读：不只看是否超标

浮游菌监测结果应与洁净级别、采样状态、采样体积、培养条件、历史趋势和操作活动共同评价。《中国药典》9205 强调，应对日常环境监测数据进行分析和回顾，通过趋势分析评估洁净实验室是否受控；同时不应只关注微生物数量，还应关注微生物种类和污染检出频率。

判读时应区分：

在受控环境中，重复采样并不等于复验原结果。空气微生物采样具有瞬时性和空间波动性，后续某次采样合格不能简单否定原先异常结果。应通过偏差调查、趋势数据和污染源分析判断。

十一、微生物鉴定的价值

浮游菌计数只告诉我们“有多少”，微生物鉴定则帮助判断“来自哪里”。《中国药典》9205 建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平鉴定；关键区域分离到的菌落应优先于非关键区域进行鉴定。

常见污染来源判断可参考：

鉴定水平应与风险匹配。A级或关键操作区检出微生物，通常比低级别背景区更需要深入鉴定和调查。

十二、浮游菌与沉降菌如何配合

浮游菌测试和沉降菌测试都评价空气微生物污染，但反映角度不同。浮游菌是主动采样，能量化单位体积空气中的可培养微生物；沉降菌是被动暴露，反映一定时间内可能沉降到暴露表面的微生物风险。

两者不能互相完全替代。对于无菌检查或无菌生产关键区域，通常需要结合浮游菌、沉降菌、表面微生物和人员监测综合判断环境受控状态。

十三、常见异常与原因分析

浮游菌结果异常应从采样、培养基、仪器、人员、环境和操作活动多方面排查。

调查不应只停留在“重新消毒”。应结合当天操作、人员、压差、温湿度、清洁记录、设备状态、采样器消毒、平板批号和历史趋势综合判断。

十四、培养基企业的关注点

对培养基企业而言，浮游菌监测用平板的质量控制与普通实验室平板不同。环境监测平板往往要进入洁净区甚至关键区，因此包装、灭菌、预培养、促生长能力和中和剂体系都很关键。

重点包括：

如果用于 A/B 级洁净区，平板的包装和灭菌控制应更加严格，避免把培养基本身作为污染源带入洁净环境。

十五、常见误区

第一，认为浮游菌测试属于无菌检查法的一部分。浮游菌是环境监测项目，用于支持洁净环境受控评价，不直接判定供试品无菌。

第二，认为采样量越大越好。采样量应与洁净级别、仪器能力和培养基状态匹配，过大可能影响回收。

第三，认为无菌落就一定环境很好。也可能是培养基失效、消毒剂残留、采样器故障或培养条件不适宜。

第四，认为只用 TSA 就能覆盖全部风险。真菌季节性风险、潮湿环境或历史真菌检出时，应考虑 SDA 或经验证方案。

第五，认为超标后重新采样合格即可。重新采样不能简单否定原异常，应按偏差程序调查。

第六，认为浮游菌和沉降菌可互相替代。二者反映不同污染风险，应结合使用。

第七，认为 Feller 校正可有可无。多孔撞击式采样器在菌落数较高时可能低估，校正逻辑应统一。

第八，认为环境菌不需要鉴定。关键区或趋势异常时，鉴定有助于定位污染源和评价控制措施。

十六、小结

浮游菌测试是药品洁净实验室和洁净区微生物监测的重要方法，主要用于评价空气中可培养微生物污染水平和环境受控状态。测试时应关注采样器类型和校准、采样头灭菌、消毒剂残留、培养基选择、采样点布置、采样体积换算、Feller 校正、培养条件、趋势分析和异常调查。现阶段 GB/T 16293—2010 仍是执行依据，新版 GB/T 16293—2025 将于 2026 年 11 月 1 日实施。企业应在现行标准和《中国药典》9205 指导原则基础上，结合自身洁净区级别、操作风险和历史微生物数据，建立科学、稳定、可追溯的浮游菌监测体系。