凝结芽孢杆菌的测定方法：从样品处理到平板计数的关键点

凝结芽孢杆菌是益生菌食品、食品用菌种制剂和功能性配料中常见的芽孢型菌。它具有形成芽孢、耐受加工和贮存条件、可在适宜环境下萌发并产生乳酸等特点，因此常被用于粉剂、片剂、糖果、饮料、乳制品和复合益生菌产品中。近年行业标准中更规范的名称是“凝结魏茨曼氏菌”，但市场资料和旧文献中仍常见“凝结芽孢杆菌”或 Bacillus coagulans 的表述。

与普通菌落总数不同，凝结芽孢杆菌的测定不能只看“总菌落数”。其检测对象通常是目标益生菌或其芽孢，样品中还可能存在其他芽孢菌、乳酸菌、酵母或食品颗粒干扰。因此，测定方法需要通过样品分散、pH 控制、适度热处理、专用培养基培养和典型菌落判读，尽可能准确地回收并计数目标菌。

一、为什么不能直接套用菌落总数方法

普通菌落总数测定通常评价食品中可培养微生物总量，而凝结芽孢杆菌测定更关注某一目标菌的数量。该菌可形成芽孢，芽孢对热、干燥、加工和贮存条件的耐受性强；同时，在复合食品中，背景微生物和食品颗粒也可能干扰计数。研究综述也将 Bacillus coagulans 描述为一种芽孢型益生菌，其耐受环境胁迫和加工条件的能力是其应用价值的重要原因之一。

因此，凝结芽孢杆菌计数方法通常包含以下逻辑：

这也是凝结芽孢杆菌检测的核心难点：不是公式复杂，而是目标菌回收、背景菌控制和菌落识别要同时成立。

二、名称变化：凝结芽孢杆菌与凝结魏茨曼氏菌

“凝结芽孢杆菌”是旧文献和商业产品中常用名称，拉丁名多写作 Bacillus coagulans。随着分类学更新，部分资料使用 Weizmannia coagulans；而 QB/T 5949—2023 采用中文名称“凝结魏茨曼氏菌”。LPSN 资料显示，Weizmannia coagulans 与 Bacillus coagulans 存在同型异名关系，提示这一类菌的命名存在分类学更新背景。

实际工作中建议采用以下原则：

名称可以更新，但菌株编号和方法依据不能模糊。对益生菌产品而言，不同菌株的生长温度、芽孢比例、耐热性和菌落形态可能不同，不能只凭名称进行替代。

三、蛋白胨稀释液：保护、分散和稀释

原文使用 0.1% 蛋白胨水作为样品稀释液。蛋白胨稀释液在微生物计数中很常见，它的作用不只是把样品稀释到合适浓度，还能在一定程度上保护菌体或芽孢，减轻渗透压变化和机械均质造成的损伤。

蛋白胨稀释液质量控制应关注：

原文中“细菌蛋白胨除外”表述不够清晰。更严谨的做法是：在 SOP 中明确蛋白胨名称、供应商、质量标准和适用性验证结果，避免因蛋白胨来源不同导致回收率差异。

四、GYE 琼脂培养基：为目标菌提供生长环境

原文采用 GYE 琼脂培养基，其配方包括酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、磷酸盐、硫酸镁、微量元素和琼脂。该培养基的设计思路是提供碳源、氮源、生长因子、无机盐和适宜的凝固环境，使凝结芽孢杆菌能够萌发并形成可计数菌落。

GYE 培养基的关键不只是“能凝固”。葡萄糖和蛋白胨在高温下可能发生反应，导致颜色加深、pH 下降或促生长能力变化；微量元素也可能出现沉淀或氧化。因此，培养基应关注终点 pH、颜色、澄清度、凝胶强度、无菌性和目标菌促生长能力。

五、微量元素：加入量小，影响不小

原文中微量元素溶液含氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜和硫酸钴。微量元素对芽孢菌萌发、生长、酶活性和菌落形成可能有促进作用，但也存在“少量有益、过量抑制”的特点。

微量元素溶液应重点控制沉淀、氧化、保存期和加入量。特别是铁盐和铜盐，容易受 pH、氧化状态和灭菌条件影响。若培养基出现颜色异常、沉淀或目标菌菌落变小，微量元素体系应列入排查范围。

六、样品制备：不同食品基质处理重点不同

原文以 25 g 样品加入 225 mL 稀释液制备 1∶10 样品匀液，这是食品微生物检验中常见的起始稀释方式。但凝结芽孢杆菌常存在于复杂食品中，样品分散难度可能高于普通食品。

原文提到对不易溶样品可温和预热帮助分散。该做法的目的在于提高基质溶解或分散程度，但加热条件必须受控。若预热过强或时间过长，可能改变芽孢状态、影响营养细胞存活或造成结果偏差。因此，应按标准方法或经确认 SOP 执行。

七、pH 调整：避免基质造成计数偏低

部分益生菌食品呈酸性，如酸味糖果、果汁饮料、发酵乳或含有机酸配方；也有部分样品因配料原因呈偏碱性。若样品悬液 pH 明显偏离方法要求，目标菌在热处理和培养前可能受到额外损伤。

pH 调整的意义在于让检测体系进入更适合目标菌回收的状态。

因此，pH 调节应充分混匀后测量，避免局部浓酸或浓碱直接接触目标菌。调节剂浓度、加入量和最终 pH 应完整记录。

八、热处理：减少背景菌，但不能损伤目标菌

原文设置了水浴热处理步骤，这是凝结芽孢杆菌计数中的重要选择性环节。其原理是利用芽孢相对耐热的特点，降低部分非芽孢背景菌干扰，使目标芽孢型菌更容易在平板上形成可计数菌落。

但热处理不是越强越好。它同时可能造成目标菌损伤，尤其是不同菌株、不同芽孢成熟度、不同食品保护体系下，耐热性可能不同。

热处理条件应按执行标准或经验证方法控制。尤其在产品放行检测中，不应随意改变水浴温度、时间、管体积或冷却方式。

九、平板培养：倾注法和菌落形态判读

原文采用倾注平板法，将样品稀释液与熔融 GYE 琼脂混合后培养。倾注法可让菌体分布在培养基内部和表面，因此计数时需要区分表面菌落和嵌入琼脂内部的菌落。

典型菌落通常可表现为：

菌落形态只能作为初筛依据。若样品为复合益生菌产品，或者可能存在其他芽孢杆菌，单靠白色乳白色菌落并不能完全确认目标菌。必要时应结合标准要求进行纯化、镜检、生化或分子鉴定。

十、阴性对照和空白控制

原文设置了只含培养基的空白平板，以及含蛋白胨稀释液和培养基的阴性对照。这是必要的质量控制步骤，用于判断培养基、稀释液和操作过程是否污染。

若阴性对照有菌落生长，应调查培养基、稀释液、平皿、移液器具和操作环境。不能在空白污染的情况下直接采用样品结果。

十一、计数范围与结果计算

原文采用 30～300 CFU 作为理想计数范围，这与常见平板计数方法一致。菌落过少时随机误差大；菌落过多时容易重叠、融合或漏计。

当只有一个稀释度平板在适宜计数范围内时，可计算两个平行平板的平均数，并乘以相应稀释倍数，作为每 g 或每 mL 样品中的目标菌数。

当两个连续稀释度均处于适宜范围时，可按下式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) d]

其中：

计算时最容易出错的是 d 的含义和单位换算。固体样品通常报告为 CFU/g，液体样品通常报告为 CFU/mL。若前处理、取样量或接种体积不同，应按实际稀释倍数换算。

十二、方法适用性和确认：复合产品尤其重要

凝结芽孢杆菌常用于复合益生菌产品。此类产品可能同时含有乳酸菌、双歧杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其他芽孢型菌。若培养基选择性不足，其他菌株可能形成类似菌落，导致结果偏高；若热处理过强，目标菌又可能被损伤，导致结果偏低。

因此，以下情况应进行方法适用性确认：

QB/T 5949—2023 已描述凝结魏茨曼氏菌计数方法，实际检测时应优先依据该标准或客户指定方法执行；旧资料可用于理解原理，但不应直接替代现行标准。

十三、培养基研发中的质量控制重点

对培养基企业而言，凝结芽孢杆菌计数培养基的研发和质控要同时关注营养性、选择性、菌落形态和批间一致性。

培养基合格不能只看无菌性和外观。对计数培养基而言，目标菌回收率、平行性、菌落可识别性和批间稳定性才是关键。

十四、常见误区

第一，认为凝结芽孢杆菌测定就是普通菌落总数。实际检测目标更明确，需要控制背景菌和菌落识别。

第二，认为热处理越强越好。过强会损伤目标芽孢或影响萌发，导致结果偏低。

第三，认为白色菌落都可计入。其他芽孢菌也可能形成相似菌落，复合产品需特别谨慎。

第四，认为样品溶解就等于菌体释放完全。糖衣、脂肪、微胶囊和颗粒载体都可能影响回收。

第五，认为 pH 调节可有可无。酸性或碱性基质会影响热处理和后续恢复。

第六，认为培养基配方照抄即可。蛋白胨、酵母粉、微量元素和葡萄糖批次都会影响性能。

第七，认为旧称和新称可以随意混用。正式文件应按执行标准名称写明，并保留菌株编号追溯。

第八，认为无阴性对照也能判读。空白污染会导致假高结果，必须设置并记录。

十五、小结

凝结芽孢杆菌测定的关键，是在复杂食品基质中准确释放、保护、筛选和计数目标芽孢型益生菌。原文所述蛋白胨稀释液、GYE 琼脂、pH 调整、热处理、倾注培养和 30～300 CFU 计数范围，体现了该类方法的基本思路。当前食品检测中，应优先关注 QB/T 5949—2023《凝结魏茨曼氏菌计数方法》，并结合产品基质、复合菌株、培养基性能和方法确认结果进行应用。对实验室而言，控制稀释、热处理、菌落判读和计算规则是重点；对培养基研发企业而言，提升培养基批间稳定性、目标菌回收率和非目标菌干扰控制，是保证计数结果可靠的核心。