平皿菌落计数法：原理、操作方式与结果计算

平皿菌落计数法是将待测样品制成适宜梯度的稀释液，接种于固体培养基并培养，使能够生长繁殖的微生物形成肉眼可见的菌落，再根据菌落数、接种体积和稀释倍数计算样品中的菌落形成单位。该方法常用于食品、药品、环境样品、发酵液及培养物中的活菌计数。

计数结果通常以CFU/mL或CFU/g表示。CFU即菌落形成单位，并不等同于单个活细胞：一个菌落可能来源于一个细胞，也可能来源于细胞团、成对细胞、菌丝片段或芽孢聚集体。因此，平皿菌落计数法测得的是在规定培养条件下能够形成菌落的微生物单位数量，而不是样品中的细胞总数。

平皿计数的基本方法

常用的平皿菌落计数方法主要包括表面涂布法和倾注平板法，二者的接种位置、适用范围及计数结果可能存在差异。

1. 表面涂布法

表面涂布法是将一定体积的样品稀释液接种到已经凝固并适当干燥的琼脂培养基表面，再使用无菌涂布棒或玻璃珠均匀涂布。

该方法通常接种0.1 mL，也可根据方法要求使用其他体积。由于菌落全部形成于培养基表面，便于观察菌落形态、颜色和溶血等特征，也有利于需氧微生物生长。正确涂布时，菌落可以较均匀地分布；原文所述“涂布法不易使菌落均匀分布”并不准确。菌落分布不均通常与培养基表面过湿、涂布不充分、样液未被及时吸收或菌悬液中存在细胞聚集有关。

表面涂布法的缺点是接种体积通常较小，对低浓度样品的检出能力有限。培养基表面过干时还可能影响受损细胞恢复，过湿则容易造成菌液流动和菌落融合。

2. 倾注平板法

倾注平板法又称混匀浇注法，是将规定体积的样品稀释液加入无菌培养皿，再倒入冷却至约44～47 ℃的熔化琼脂培养基，充分混匀后静置凝固并培养。

该方法通常可接种1 mL样液，检出能力一般高于接种0.1 mL的涂布法。菌落既可形成于培养基表面，也可形成于琼脂内部，分布通常较均匀。

倾注平板法也存在局限。熔化培养基温度过高或样品与培养基接触时间过长，可能损伤热敏感或处于亚致死状态的细胞；琼脂内部氧气供应较少，部分严格好氧菌生长受限；形成于培养基内部的菌落通常较小，形态特征也不如表面菌落清晰。因此，倾注法与涂布法所得结果不一定完全一致，检测时应按照相应标准固定方法。

样品稀释与平行接种

微生物浓度较高的样品必须先进行十倍系列稀释，使接种后的菌落数量落入所用方法规定的可计数范围。稀释液应适合目标微生物，并避免因渗透压、pH或抑菌成分导致细胞死亡。常用稀释液包括无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液和蛋白胨盐溶液等。

每次稀释前均应充分混匀，并使用新的无菌吸头或移液管，防止上一级稀释液残留造成稀释误差。易沉降、成团或形成链状排列的菌液需要采用适宜的振荡或分散方式，但过度剪切也可能损伤细胞。

平行平皿数量应按照具体标准执行。常规检测多采用每个稀释度两个平行平皿，并非必须设置三个以上。科研试验为提高统计可靠性，可根据需要增加平行数。

可计数菌落范围

原文建议每个直径9 cm平皿计数50～500 CFU，这一范围过宽。菌落过多时容易相互融合、争夺营养或产生抑制作用，从而低估实际数量；菌落过少时随机误差较大。

不同标准和检测对象规定的计数范围并不完全相同，常见要求如下：

当平皿菌落过多、菌落融合或整个平皿连续生长时，应记录为菌落不可计数，并选用更高稀释度。若所有平皿菌落数均低于方法规定的最低范围，可报告估计值或低于检出限，但不得随意按常规计数结果处理。

菌落数的计算

当选定稀释度的平行平皿均处于可计数范围时，可根据平均菌落数、稀释倍数和接种体积计算样品中的菌落形成单位。

例如，将10⁻⁵稀释液涂布0.1 mL，平行平皿平均形成85个菌落，则原样品浓度为：

85 ÷（10⁻⁵ × 0.1）= 8.5 × 10⁷ CFU/mL。

当两个连续稀释度均符合计数要求时，不宜简单分别计算后取平均，而应按照检测标准规定的加权公式处理。报告结果时还应遵循有效数字、修约规则及检出限要求。

影响计数准确性的主要因素

平皿菌落计数结果受到样品状态、培养基和培养条件等多种因素影响。细胞聚集会使多个细胞只形成一个菌落；培养基营养不足或选择性过强，会使部分细胞不能形成菌落；培养温度、时间、气体条件或pH不适宜，也会造成计数偏低。

受损细胞可能仍具有生命活性，却不能直接在选择性培养基上形成菌落，需要经过非选择性预培养或损伤修复后才能检出。相反，培养时间过长可能使小菌落被大菌落覆盖，或因扩散性生长导致菌落融合。

培养皿中的冷凝水、琼脂表面湿度、接种液吸收情况以及操作过程中的污染，也会影响计数结果。开展菌落计数时，应设置培养基空白对照，并对稀释、接种和培养条件进行统一控制。

平皿计数法的适用范围与局限

平皿菌落计数法适用于多数能够在人工培养基上形成独立菌落的细菌和酵母菌，也可用于部分霉菌计数。原文称其“不适于霉菌等多细胞微生物”过于绝对。霉菌计数可采用适宜的培养基和培养条件，但一个菌落可能由单个孢子、孢子团或菌丝片段形成，因此结果同样应表示为CFU，而不能解释为霉菌细胞数量。

平皿计数法只能检测在选定培养条件下可培养的微生物。处于活的但不可培养状态的细胞、对培养条件有特殊要求的微生物以及已受损但尚未恢复的细胞，均可能无法形成菌落。因此，该方法通常低估样品中的实际活细胞总量。

一个可见菌落需要经过多次细胞分裂形成，但所需代数并非固定为25代，而取决于初始细胞数量、菌落大小、菌种生长速度和观察条件。快速微菌落计数技术可通过膜过滤、荧光染色或显微成像，在菌落达到肉眼可见大小之前进行检测，从而缩短检测时间，但其设备、方法验证和结果判定要求与常规平皿法不同。

规范操作是准确计数的基础

平皿菌落计数法操作直观，但其结果并不只取决于菌落数量。样品分散性、稀释准确度、接种体积、培养基适用性、培养条件和计数规则都会直接影响最终结果。

实际检测时，应优先执行相应国家标准、药典或行业方法，按照规定选择涂布法或倾注法、可计数范围、平行平皿数量及结果计算方式。只有对全过程进行标准化控制，所得CFU结果才具有可比性和实际意义。