纽和克尔培养基：配方原理与土壤杆菌分离方法

纽和克尔培养基又称 New and Kerr培养基、N&K培养基或NK培养基，是一种以赤藓糖醇为主要碳源，并加入多种抑菌剂的选择性固体培养基。该培养基最初由New和Kerr于1971年建立，主要用于从土壤、植物根际及根组织中选择性分离旧分类体系中的 Agrobacterium radiobacter biotype 2，即土壤杆菌生理型2，而不是用于无差别分离所有土壤杆菌。(PubMed)

土壤杆菌的分类名称经过多次调整。传统资料中的土壤杆菌生理型2也常称为 Agrobacterium biovar 2或 A. rhizogenes 类群，现代分类资料多使用 Rhizobium rhizogenes；2026年又有将其组合为 Martinezella rhizogenes 的方案，但目前推荐名称和分类处理仍存在不同意见。因此，在介绍该经典培养基时，保留“土壤杆菌生理型2”这一历史分组更便于理解其原始用途。(LPSN)

培养基配方

基础培养基

选择性附加成分

附加成分共同抑制真菌和部分细菌，使能够利用赤藓糖醇并耐受选择剂的目标菌株形成菌落。不过，这些选择剂也可能抑制部分受损或敏感的目标菌株，因此该培养基应称为选择性或半选择性培养基，不能认为具有绝对选择性。

选择性原理

纽和克尔培养基的核心选择依据是赤藓糖醇利用能力。传统生理分型中，生理型2土壤杆菌通常能以赤藓糖醇作为主要碳源，而许多其他土壤微生物不能有效利用这种物质。在缺少蛋白胨、酵母浸粉等复杂有机营养的条件下，伴生异养菌的生长受到进一步限制。

放线菌酮用于抑制真菌，杆菌肽和短杆菌素主要抑制敏感细菌，亚硒酸钠则增加对土壤背景菌群的抑制作用。硝酸钠提供氮源，生物素、镁、钙和铁等成分维持目标菌株的基本生长需要。

这种选择机制并非完全可靠。后续调查发现，部分归入生理型2的土壤杆菌不能利用赤藓糖醇，因而不能在以赤藓糖醇为唯一碳源的培养基上正常生长；另一方面，某些非目标环境菌也可能利用赤藓糖醇并耐受选择剂。纽和克尔培养基上的菌落通常生长较慢，后续开发的2E培养基可使部分生理型2菌株生长得更快。(ASM Journals)

Fe-EDTA储备液的配制

称取硫酸亚铁七水合物278 mg和乙二胺四乙酸二钠372 mg，加入约80 mL热水，充分搅拌溶解后冷却并定容至100 mL。每升基础培养基加入该储备液2 mL。

278 mg硫酸亚铁七水合物约为1 mmol，372 mg乙二胺四乙酸二钠对应的通常是二水合物规格，同样约为1 mmol，可形成近似等摩尔的Fe-EDTA储备液。若使用无水乙二胺四乙酸二钠，应根据其实际相对分子质量重新换算，不能仍直接称取372 mg。

Fe-EDTA储备液应避光保存，出现明显浑浊、棕色沉淀或长期放置后不宜继续使用。配制时应避免将高浓度铁盐直接加入含磷酸盐的培养基，否则容易形成难溶性沉淀。

制备方法

将赤藓糖醇、硝酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、琼脂及Fe-EDTA储备液加入蒸馏水中，加热溶解并定容至1000 mL。调节pH至7.0，分装后于121 ℃灭菌15分钟。

灭菌结束后将基础培养基冷却至约45～50 ℃。放线菌酮、杆菌肽、短杆菌素和亚硒酸钠应分别配制为适宜浓度的储备液，并按照各试剂溶解性选择溶剂，经0.22 μm滤膜除菌后无菌加入，充分混匀并倾注平板。

原配方未注明氯化钙是否为无水物。不同水合状态的氯化钙相对分子质量不同，复现配方时应固定原料规格，并在产品或实验记录中明确标注。短杆菌素的具体制剂纯度和效价也可能影响选择强度，应按所用试剂批次进行换算和验证。

放线菌酮和亚硒酸钠具有较强毒性，配制时应佩戴手套并避免产生粉尘。含有这些物质的废弃培养基应按照实验室化学及生物废物要求处理。

样品接种与培养

取土壤、根际土或植物组织浸出液，使用无菌缓冲液或生理盐水制成悬液。经充分振荡并静置较大颗粒后进行十倍系列稀释，选择适宜稀释度涂布于纽和克尔培养基平板。

通常可在25～28 ℃条件下培养，并于培养第4～7天开始观察。由于目标菌株在该培养基上生长较慢，不能在24～48小时无菌落时即判定为阴性；必要时应适当延长培养时间。已有应用研究采用25 ℃培养约4天回收土壤杆菌生理型2，但不同菌株和样品的生长时间可能不同。(APS Home)

土壤样品中杂菌较多，接种量过大容易造成菌落融合和选择剂消耗。应同时设置多个稀释度，并设置未接种培养基作为无菌对照。对于受损菌体或目标菌数量很低的样品，可先在低选择性培养基中短时间恢复，但预增菌也可能改变原始菌群比例。

结果判定与菌株确认

能够在纽和克尔培养基上形成菌落，只能表明该菌株能够利用培养基营养并耐受选择剂，不能直接确定其为土壤杆菌。应挑取分离良好的候选菌落，在适宜的非选择性培养基上纯化，再进行后续鉴定。

可采用的确认项目包括革兰染色、细胞形态、运动性、氧化酶和过氧化氢酶试验、赤藓糖醇利用试验以及16S rRNA基因或多位点序列分析。若检测对象是植物致病菌，还应进一步检测Ti或Ri质粒相关基因，并结合植物致病性或组织诱导试验。选择培养基上的生长结果不能代替菌种鉴定和致病性确认。

应用范围与局限

纽和克尔培养基适合从土壤、根际、植物组织及根癌病相关样品中选择性分离传统分类体系中的土壤杆菌生理型2，也可作为相关菌株的生理鉴别培养基。

原资料将其用途笼统表述为“从土壤中分离培养土壤杆菌”并不准确。该培养基对生理型1、生理型3及部分不能利用赤藓糖醇的生理型2菌株回收能力有限，可能产生假阴性；同时，少数非目标菌也能形成菌落，可能产生假阳性。环境样品检测时，宜将纽和克尔培养基与其他选择培养基、纯化培养和分子鉴定方法联合使用，避免仅凭单一培养基作出菌种结论。