微生物分离纯化方法

微生物样品中常含有多种细菌、酵母、霉菌或放线菌。若要研究某一菌株的形态、生理生化特征、产酶能力或培养基适用性，首先需要将混合菌群分离成相对纯的单一菌株。微生物分离纯化的核心思想，是通过稀释、划线、选择性培养或单细胞操作，使单个或少数微生物细胞在培养基上形成彼此分开的菌落，再挑取目标菌落进行纯化和鉴定。

常见分离纯化方法包括平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合倒平板法、稀释摇管法、液体培养基分离法、选择培养分离法和单细胞分离法。其中，平板划线法、稀释涂布法和倒平板法最常用，操作相对简单，不需要复杂仪器，适用于大多数基础微生物实验。

一、分离纯化的基本原则

分离纯化并不是“看到单个菌落”就一定得到纯菌。一个菌落通常由一个细胞、一个孢子或一个细胞团繁殖形成，因此更准确的单位是CFU，即菌落形成单位。若样品中细胞成团、链状排列或菌丝断裂不充分，一个菌落可能来源于多个细胞。

因此，获得疑似单菌落后，还应进行再次划线纯化，并结合菌落形态、显微形态、染色结果和必要的生化或分子检测确认纯度。对于混合菌样品、环境样品和食品样品，通常需要经过2次以上单菌落纯化，才能作为后续实验用菌株。

二、平板划线分离法

平板划线法是最常用的菌种纯化方法。操作时，用接种环或一次性无菌接种环蘸取少量待分离材料，在固体培养基表面按一定路线连续划线。随着划线区域推进，接种环携带的细胞数量逐渐减少，最终可在平板后部形成分散的单个菌落。

常见划线方式包括三区划线、四区划线、连续划线和平行划线。无论采用哪种方式，关键都是逐步减少接种量，并避免划线过密或反复破坏琼脂表面。

平板划线法特别适合从混合培养物中挑取单菌落，也适合复核菌株纯度。若划线后所有区域均密集生长，说明接种量过大或划线稀释效果不足，应减少取样量或增加划线分区。

三、稀释涂布平板法

稀释涂布平板法是将样品制成系列稀释液后，取一定体积滴加于固体培养基表面，再用无菌涂布器均匀涂布。培养后，微生物在平板表面形成菌落，可用于分离单菌落，也可用于活菌计数。

原文称“一个菌落代表一个单细胞”不够严谨。准确说法是：一个菌落代表一个菌落形成单位。该单位可能是一个单细胞，也可能是一个细胞团、一个芽孢、一个酵母细胞或一段菌丝。

稀释涂布法并不只是用于“筛选菌株”，更常用于食品、水、土壤、菌剂和培养基性能评价中的活菌计数。若用于筛选菌株，也通常需要结合选择性培养基、显色培养基或特定功能检测方法。

四、样品稀释液的制备

样品稀释的目的是降低微生物浓度，并尽量使细胞或孢子分散。常用稀释液包括无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、蛋白胨盐水或标准方法规定的稀释液。不同检测标准对稀释液、均质方式和稀释时间可能有具体要求，应优先按标准执行。

以固体样品为例，可称取10 g样品加入90 mL无菌稀释液中，经均质、振荡或拍击处理，制成10⁻¹稀释液。随后取1 mL 10⁻¹稀释液加入9 mL无菌稀释液中，混匀后得到10⁻²稀释液，以此类推制备10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵等系列稀释液。

稀释操作应注意：

• 每一步稀释前必须充分混匀；

• 每个稀释度应更换无菌吸头或移液管；

• 稀释液不宜长时间放置后再接种；

• 易沉降样品应在混匀后立即取样；

• 含菌团、菌丝或颗粒较多的样品，应选择合适均质方式。

原文中的“吹吸3次”只能作为最低混匀动作，实际操作中常需涡旋、振荡或拍击均质，以提高细胞分散程度。对土壤、粉末和霉菌孢子样品，适当加入玻璃珠或表面活性剂有时可改善分散效果，但应确认其不影响目标菌活性。

五、稀释度和接种量选择

选择稀释度时，应使培养后平板上形成可分辨、可计数的菌落。细菌计数常参考30～300 CFU/皿的范围；霉菌、酵母或特殊方法可能采用不同可计数范围，应以相应标准为准。

常见样品可参考以下稀释范围：

这些范围只是经验参考。实际检测应根据样品含菌量、目标菌生长速度、培养基选择性和预实验结果调整。若菌液密度过高，平板会出现菌落融合，无法获得单菌落或准确计数；若稀释度过高，则菌落过少，代表性不足。

涂布接种体积通常为0.1 mL，也可根据方法采用0.05 mL、0.2 mL或其他体积。接种体积过大时，液体不易被培养基表面吸收，容易造成菌落蔓延和分布不均。

六、涂布操作要点

涂布前，平板表面应适度干燥。表面水分过多会导致菌液流动、菌落蔓延或边缘聚集；平板过干则可能影响细胞恢复和菌落形成。

传统玻璃涂布器可用75%乙醇浸泡后火焰灼烧，待酒精完全燃尽并充分冷却后再接触菌液。若涂布器未冷却，会造成目标菌热损伤；若带有过多乙醇，会抑制微生物生长。现在也常使用一次性无菌L形涂布棒或无菌玻璃珠，以减少火焰使用和交叉污染风险。

需要注意的是，在生物安全柜内通常不推荐使用明火，避免破坏气流、损伤过滤系统或引发火灾。处理致病菌或疑似致病菌时，应按生物安全要求选择无火焰操作方式。

七、稀释混合倒平板法

稀释混合倒平板法是将一定体积稀释液加入培养皿，再倒入冷却至约45～50 ℃的熔化琼脂培养基，轻轻旋转混匀，凝固后培养。微生物可在培养基内部和表面形成菌落。

该方法常用于活菌计数，接种体积通常可达到1 mL，因此检出能力高于普通0.1 mL涂布法。但其缺点是目标菌需要短时间接触温热培养基，热敏微生物可能受损；同时，培养基内部菌落较小，严格好氧菌的生长也可能受到限制。

八、选择培养分离法

选择培养分离法是利用培养基成分、pH、温度、氧气、盐浓度、抗生素、染料或特定底物，抑制非目标菌并促进目标菌生长。常见选择性培养基包括麦康凯琼脂、XLD琼脂、Baird-Parker琼脂、孟加拉红培养基等。

选择培养法适合从复杂样品中分离目标菌，如食品、环境、水样和临床样品中的特定微生物。但选择性培养基并非绝对专一，目标菌可能被过强选择剂抑制，非目标菌也可能出现突破生长。因此，选择培养后的疑似菌落仍需进一步确认。

九、液体培养基分离法与富集培养

液体培养基分离法常用于目标菌数量低、受损菌较多或背景菌复杂的样品。通过选择性富集或增菌培养，可提高目标菌比例，再转接到固体培养基上分离单菌落。

例如，沙门菌、李斯特菌、阪崎克罗诺杆菌等检测中常需要预增菌和选择性增菌步骤。富集培养的优点是提高检出率，缺点是可能改变原始菌群比例，因此不适合直接用于定量分析。

十、单细胞分离法

单细胞分离法是借助显微操作、流式分选、微滴分离或微量稀释技术，直接获得单个细胞并进行培养。该方法适用于形态相近、常规平板难以分开的微生物，也可用于环境微生物、藻类、原生动物或特殊菌株分离。

单细胞分离准确性高，但对设备、操作技术和培养条件要求较高。对于生长条件未知或依赖共生关系的微生物，单细胞分离后未必能够顺利培养。

十一、纯化后的确认

分离得到的单菌落应再次划线纯化。纯化后可从以下方面确认菌株是否纯净：

若同一菌落再次划线后出现不同形态菌落，应考虑原菌落并非纯菌，或存在污染、相变、变异和混合菌共生等情况。

小结

微生物分离纯化的本质，是将混合微生物逐步分散、筛选并获得稳定的纯培养物。平板划线法适合菌种纯化，稀释涂布法适合分离和计数，倒平板法适合较大体积样品计数，选择培养法适合复杂样品中的目标菌分离。

无论采用哪种方法，都应认识到“单菌落”并不绝对等于“单细胞来源”。规范的稀释、接种、培养、再次纯化和纯度确认，才是获得可靠菌株和准确检测结果的关键。