样品中大肠埃希氏菌的分离方法解读：从LST、EC到TBX的逐级筛选

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是食品微生物检验中常用的卫生指示菌之一。由于其主要栖息于人和温血动物肠道，食品中大肠埃希氏菌的数量可在一定程度上反映生产、加工和储存过程中的卫生状况及粪便污染风险。

需要首先明确，大肠埃希氏菌与“大肠菌群”并不是同一概念。大肠埃希氏菌是埃希氏菌属中的一个明确菌种，而大肠菌群是食品卫生微生物学中的一类指示菌群，并非严格的细菌分类学单位，通常包括埃希氏菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等相关细菌。因此，大肠菌群阳性不能直接等同于检出大肠埃希氏菌。

食品中大肠埃希氏菌计数目前应依据现行的 GB 4789.38—2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数》。该标准于2025年发布，替代GB 4789.38—2012。与旧版相比，新版标准的重要变化之一，是MPN法不再采用传统的“EC肉汤→EMB琼脂→纯培养→IMViC生化鉴定”路线，而改为利用TBX显色培养基直接进行确认。

大肠埃希氏菌为什么可以被逐级筛选？

现行方法主要利用大肠埃希氏菌两个具有检测价值的生理生化特征：其一是在44.5 ℃条件下仍可发酵乳糖并产酸、产气；其二是多数大肠埃希氏菌具有β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase）活性，能够水解TBX培养基中的显色底物并形成典型蓝绿色菌落。

因此，MPN法并不是依靠一种“高度特异”的培养基直接把目标菌挑选出来，而是采用：

LST初步筛选 → EC高温选择 → TBX显色确认

这种逐级增加选择压力和鉴别特征的方式，既有利于目标菌从复杂食品微生物背景中恢复生长，又可逐步排除非目标菌。

LST、EC和TBX三种培养基分别起什么作用？

现行GB 4789.38—2025中，MPN法涉及的核心培养基为月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、EC肉汤和胰蛋白胨胆盐X-葡萄糖醛酸苷琼脂（TBX）。

LST肉汤：第一步不能设置得过于“苛刻”

LST肉汤每升典型配方包括胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g、氯化钠5.0 g、乳糖5.0 g、磷酸氢二钾2.75 g、磷酸二氢钾2.75 g及月桂基硫酸钠0.1 g，灭菌后pH为6.8±0.2。

其中，乳糖既是可利用碳源，也是产气反应的基础；月桂基硫酸钠则提供适度选择性，能够抑制部分非目标微生物，同时允许大肠埃希氏菌及部分相关肠杆菌生长。

这种设计非常重要。样品中的大肠埃希氏菌可能受到冷冻、干燥、酸、盐或加工过程影响而处于亚致死损伤状态，如果初始培养基选择压力过高，反而可能造成目标菌漏检。因此，LST的任务并不是最终确认，而是尽可能恢复并捕获可能存在的乳糖发酵产气菌。

按照现行标准，每个样品选择3个适宜连续稀释度，每个稀释度通常接种3管LST肉汤；36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h观察产气，未产气者继续培养至48 h±2 h。产气管进入下一步EC肉汤复发酵试验。

EC肉汤：44.5 ℃是选择性的关键组成部分

EC肉汤每升含胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g、3号胆盐或混合胆盐1.5 g、乳糖5.0 g、磷酸氢二钾4.0 g、磷酸二氢钾1.5 g和氯化钠5.0 g，灭菌后pH为6.9±0.2。

与LST相比，EC肉汤的选择性主要来自两个方面：一是胆盐抑制部分非目标菌；二是将培养温度提高至44.5 ℃±0.2 ℃。后者尤其重要，它利用大肠埃希氏菌相对较好的耐热性进一步排除部分肠杆菌及其他背景菌。

LST产气培养物转种EC肉汤后，于44.5 ℃±0.2 ℃培养24 h±2 h；未产气时继续培养至48 h±2 h。48 h以内出现产气的培养管再进入TBX确认步骤。

因此，不能把EC肉汤简单理解为“比LST抑制性更强的肉汤”。实际上，胆盐选择性＋高温培养＋乳糖产气反应三者共同构成了EC肉汤的筛选机制。

TBX琼脂：从传统生化鉴定转向酶显色确认

TBX是胰蛋白胨胆盐X-葡萄糖醛酸苷琼脂（Tryptone Bile X-glucuronide Agar）。现行标准每升含胰蛋白胨20.0 g、3号胆盐1.5 g、BCIG 144 μmol以及琼脂9.0～18.0 g，灭菌后pH为7.2±0.2。

其中最关键的成分是显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷（BCIG）。具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性的细菌可以水解该底物，最终形成有色产物，使典型大肠埃希氏菌菌落呈蓝绿色。

EC产气管划线接种TBX琼脂后，于36 ℃±1 ℃培养18～24 h。如果平板出现蓝绿色菌落，则对应EC肉汤管判定为大肠埃希氏菌阳性；否则判定为阴性。

这也是GB 4789.38—2025相较旧版方法最直观的变化。过去常采用EMB琼脂观察典型菌落，再经过纯培养、革兰氏染色和IMViC等生化试验确认；现行标准则直接使用TBX显色，大幅缩短了确认流程。

需要注意的是，蓝绿色显色是标准检测体系中的确认依据，而不是“所有大肠埃希氏菌在任何情况下都必然显色”的绝对生物学特征。因此，TBX结果应结合标准规定的前处理、培养条件和完整检测流程进行判定。

MPN法的完整检测逻辑

GB 4789.38—2025第一法主要适用于大肠埃希氏菌含量较低的食品。其核心流程可以概括为：

25 g（mL）样品＋225 mL稀释液 → 制备1∶10样品匀液 → 十倍系列稀释 → LST肉汤36 ℃初发酵 → 产气管转种EC肉汤 → 44.5 ℃复发酵 → EC产气管划线TBX → 36 ℃培养18～24 h → 根据蓝绿色菌落确定阳性管 → 查MPN表计算结果。

标准规定，从制备样品匀液开始至完成LST接种，整个过程不得超过15 min。一般样品采用3个连续稀释度、每个稀释度3管的MPN体系；贝类及其产品则每个稀释度接种5管，并使用相应的MPN检索表。

这一流程实际上包含三个连续的判定层级：

第一层：是否能够发酵乳糖产气；
第二层：是否能够在44.5 ℃选择条件下继续产气；
第三层：是否具有符合标准要求的β-葡萄糖醛酸苷酶显色特征。

通过三个层级逐步缩小范围，比单独依靠乳糖发酵或某一种选择剂具有更高的检测可靠性。

平板计数法：直接利用TBX完成选择与计数

GB 4789.38—2025第二法适用于大肠埃希氏菌含量较高的食品，但不适用于贝类及其产品。

检测时选择2～3个适宜连续稀释度，每个稀释度接种两个培养皿，每皿加入1 mL样品匀液，再倾注15～20 mL冷却至48 ℃±2 ℃的TBX琼脂，混匀凝固后倒置，于36 ℃±1 ℃培养18～24 h。

培养后直接计数蓝绿色典型菌落。标准优先选择典型菌落数在15～150 CFU之间的平板进行计算，并根据样品取样方式分别以CFU/g或CFU/mL报告结果。

EMB培养基现在还有什么意义？

在早期GB 4789.38方法中，伊红美蓝琼脂（EMB）曾是大肠埃希氏菌分离的重要培养基。典型大肠埃希氏菌在EMB上通常形成深色菌落，部分菌株可表现出明显的绿色金属光泽。

EMB的鉴别机制主要依赖乳糖发酵产生酸性代谢物，使伊红和美蓝发生沉淀，从而产生特征性菌落颜色。但这种表型并非绝对特异，大肠菌群中的其他强乳糖发酵菌也可能产生深色菌落，而部分大肠埃希氏菌的金属光泽并不明显。

因此，在现行GB 4789.38—2025大肠埃希氏菌计数方法中，EMB已经不再作为MPN法规定的确认培养基，核心培养基体系已经由原来的LST、EC、EMB转变为LST、EC和TBX。

小结：理解培养基之间的“分工”比记流程更重要

大肠埃希氏菌的分离并不是简单依靠某一种培养基的强选择性完成，而是通过不同培养基承担不同任务：

LST负责“尽量不漏掉目标菌”，EC负责“进一步排除非目标菌”，TBX负责“利用特征酶活进行显色确认”。

这种设计体现了食品微生物选择性培养基的一项基本原则——前期培养重视目标菌恢复率，中间阶段逐渐增加选择压力，最终阶段利用稳定的鉴别特征完成确认。

因此，在培养基性能评价中，也不能仅观察“大肠埃希氏菌能不能长”。LST应重点关注目标菌生长和产气能力以及对非目标菌的适度选择性；EC还需关注44.5 ℃条件下目标菌的稳定产气性能；TBX则同时要求良好的目标菌回收率、背景菌抑制性和清晰稳定的蓝绿色显色效果。只有三个环节性能相互匹配，才能保证整个大肠埃希氏菌检测体系具有良好的检出能力和结果可靠性。

**参考标准：GB 4789.38—2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数》。**该标准于2025年3月16日发布，并已替代GB 4789.38—2012。