2025版《中国药典》中菌悬液的制备与保存要点

在2025版《中国药典》微生物检查相关方法中，无菌检查、微生物限度检查、控制菌检查以及培养基适用性检查均会使用规定试验菌株制备菌悬液。菌悬液看似只是试验前处理步骤，但其菌体活力、分散均匀性和菌数稳定性，会直接影响培养基促生长能力、抑制能力、指示能力以及方法适用性结果的判断。

不同微生物的生长方式、需氧特性、耐受能力和保存稳定性差异明显，因此菌株活化条件、稀释液选择和菌悬液保存时间不能简单统一。规范制备菌悬液，是保证药典微生物检查结果准确、稳定和可追溯的重要环节。

一、常用试验菌株的活化

药典微生物检查中常见试验菌包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉等。不同菌株应根据其生理特性选择适宜培养基和培养条件。

对于普通细菌，通常选择18～24小时的新鲜培养物制备菌悬液。培养时间过短可能菌量不足，培养时间过长则可能出现菌体老化、活力下降或菌数不稳定。对于黑曲霉，应选择孢子形成充分的培养物，而不是以菌丝团作为主要制备对象。

二、菌悬液的制备

菌悬液制备的基本原则，是将新鲜培养物或孢子均匀分散于适宜稀释液中，并根据试验要求调整至规定菌数范围。常用稀释液包括0.9%氯化钠溶液、pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液和pH 7.2磷酸盐缓冲液。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌，可使用上述稀释液进行菌体洗脱和梯度稀释。制备时应挑取典型、生长良好的新鲜培养物，避免混入培养基碎屑或异常菌落。对于液体培养物，应注意充分混匀；对于琼脂培养物，可用无菌接种环或棉拭子轻轻刮取菌苔，再加入稀释液中分散。

生孢梭菌为严格厌氧菌，营养细胞对氧气敏感。其菌悬液可使用0.9%氯化钠溶液、pH 7.2磷酸盐缓冲液或pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制备。其中，pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液因含少量蛋白胨，对菌体有一定保护作用，短时间内通常更有利于维持活性。但无论选择何种稀释液，生孢梭菌营养细胞悬液均不宜长时间放置。

黑曲霉通常制备孢子悬液。可用0.9%氯化钠溶液、pH 7.2磷酸盐缓冲液或其他适宜稀释液冲洗斜面或平板表面的孢子。由于霉菌孢子表面疏水，容易聚集，不利于准确计数和均匀接种，通常可在稀释液中加入适量聚山梨酯80，如0.05%，以帮助孢子分散。制备后可通过振荡、涡旋或玻璃珠辅助分散，使孢子悬液尽量均一。

三、菌悬液的保存

菌悬液原则上应现用现制。保存时间过长可能导致菌体死亡、继续繁殖、孢子萌发或分散状态改变，从而影响实际接种菌数。

对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌，若使用0.9%氯化钠溶液或pH 7.2磷酸盐缓冲液制备，室温下通常不宜超过2小时，2～8℃保存通常不宜超过24小时。若使用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制备，因其中含少量蛋白胨，可为微生物提供一定营养，长时间放置可能导致菌体继续繁殖，使菌数升高，因此更建议在2小时内使用。

生孢梭菌营养细胞悬液稳定性较差，制备后建议在15分钟内使用。放置时间过长，活菌数可能明显下降，导致接种量低于预期。若需要较长时间保存，可考虑制备生孢梭菌孢子悬液。孢子较营养细胞更稳定，具有较强抵抗力，可在2～8℃条件下于经验证的有效期内保存。制备孢子悬液时，需先培养至形成足够芽孢，再通过适当热处理杀灭营养细胞，例如80℃水浴约10分钟，随后洗涤、稀释并进行计数确认。

黑曲霉孢子悬液相对稳定，可在2～8℃条件下保存，并在经验证的有效期内使用，部分经验证的孢子悬液可保存数周至数月。但长期保存时，建议使用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液，不宜使用含营养成分较高的稀释液。若使用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液长期保存，黑曲霉孢子在低温下仍可能发生缓慢萌发或菌丝生长，影响孢子状态和计数准确性。

四、菌悬液制备中的关键控制点

菌悬液的质量控制应重点关注菌株来源、传代次数、培养时间、稀释液类型、保存温度和使用期限。用于药典检查的试验菌株应来自可靠来源，并控制在规定传代范围内。制备菌悬液时，应选择典型、新鲜、无污染的培养物，避免使用过度培养或性状异常的菌株。

菌悬液浓度不能仅凭肉眼浊度判断。对于培养基适用性检查、方法适用性试验或偏差调查，建议通过平板计数确认菌液浓度，确保接种量符合药典要求。尤其是黑曲霉孢子悬液和生孢梭菌悬液，因分散性和存活性影响较大，更应重视计数确认和有效期验证。

同时，菌悬液制备和使用过程应做好记录，包括菌株名称、编号、来源、传代次数、培养基、培养条件、稀释液、制备时间、保存条件、理论浓度、实测浓度和使用截止时间。对于易死亡、易繁殖或易萌发的菌悬液，应缩短保存时间，优先采用现制现用方式。

五、小结

2025版《中国药典》相关微生物检查对菌悬液的使用提出了明确的规范化要求。普通细菌和白色念珠菌菌悬液应尽量短时间内使用；生孢梭菌营养细胞对氧敏感，应快速制备、快速使用，必要时可采用孢子悬液；黑曲霉则更适合制备孢子悬液，并通过聚山梨酯80改善孢子分散性。

菌悬液的制备与保存不仅关系到试验菌是否“接进去”，更关系到实际接种量是否准确、菌体活力是否可靠、试验结果是否可重复。实验室在执行药典微生物检查时，应将菌悬液管理作为培养基适用性检查和方法适用性试验的重要质量控制环节。