O/F 培养基的原理和使用方法：如何区分细菌氧化型与发酵型代谢？

O/F 培养基又称氧化发酵培养基，经典名称为 Hugh-Leifson O/F 培养基，主要用于鉴别细菌对葡萄糖等糖类的代谢方式。它常用于革兰氏阴性杆菌的初步生化鉴别，尤其适合区分细菌是通过发酵途径利用糖，还是通过氧化途径利用糖，或完全不分解该糖。

在微生物鉴定中，“能不能分解糖”并不是唯一问题，更重要的是细菌在有氧和缺氧条件下如何利用糖。O/F 试验正是通过设置一支开放管和一支封闭管，观察两种氧气条件下培养基是否产酸变黄，从而判断菌株代谢类型。

一、O/F 培养基的试验原理

O/F 培养基中含有较低浓度的蛋白胨、一定量葡萄糖、少量琼脂和 pH 指示剂溴麝香草酚蓝。胰酪蛋白胨提供氮源、维生素和矿物质；葡萄糖作为碳源；氯化钠维持渗透压；磷酸氢二钾提供一定缓冲能力；琼脂使培养基呈半固体状态，限制氧气扩散；溴麝香草酚蓝用于显示 pH 变化。

试验时，同一菌株需要同时接种两支 O/F 培养基。其中一支接种后在培养基表面覆盖无菌液体石蜡或无菌矿物油，称为封闭管，用于隔绝空气，形成相对缺氧环境；另一支不加油，称为开放管，保持有氧环境。

如果细菌能发酵葡萄糖，即使在缺氧条件下也能产酸，因此开放管和封闭管都会变黄。如果细菌只能通过氧化途径利用葡萄糖，则只有在有氧的开放管中产酸变黄，封闭管通常不变黄或变化很弱。如果细菌不分解葡萄糖，两支管都不产酸，培养基多保持绿色或偏碱性。

二、O/F 培养基配方及成分作用

该配方可根据检测目的进行调整，例如将葡萄糖替换为乳糖、麦芽糖、甘露醇、木糖等其他碳源，用于观察菌株对不同糖类的氧化或发酵能力。但在标准化鉴定中，应按对应标准或产品说明书执行，不宜随意改变配方。

三、为什么 O/F 培养基蛋白胨含量较低？

O/F 培养基中蛋白胨含量相对较低，这是该培养基设计中的关键点。若蛋白胨过高，某些不分解糖的细菌可利用蛋白胨产生碱性代谢产物，使培养基偏碱，掩盖弱产酸反应，导致结果不易判断。

同时，葡萄糖含量相对较高，有利于放大糖分解产酸现象。这样，当菌株利用葡萄糖产酸时，培养基会由绿色变为黄色；若不利用葡萄糖，则不会出现明显酸化。低蛋白胨、高糖含量和半固体结构共同构成了 O/F 培养基的鉴别基础。

四、使用方法

取 O/F 培养基干粉按说明称量，加入蒸馏水或去离子水中，加热溶解后分装试管。常见分装量为每管约 3 mL，经适宜条件灭菌后备用。培养基应呈绿色至蓝绿色，表面平整，无污染、无明显气泡或脱水现象。

试验时，用接种针挑取纯培养物，同时穿刺接种两管 O/F 培养基。接种时应沿培养基中央垂直穿刺至接近管底，再沿原路径拔出，避免过度搅动培养基。接种后，其中一管加入无菌液体石蜡或无菌矿物油，覆盖厚度一般不少于 5 mm，作为封闭管；另一管不加油，作为开放管。

接种后的培养基通常置 36℃±1℃培养 24～48 h，并观察颜色变化。部分菌株反应较慢，可根据标准或产品说明适当延长观察时间，但不宜无限延长，以免蛋白胨分解、氧扩散或培养基干缩影响判读。

五、结果如何判断？

O/F 试验主要观察开放管和封闭管的颜色变化。溴麝香草酚蓝在中性附近呈绿色，酸性条件下变黄色，碱性条件下可呈蓝绿色至蓝色。

开放管和封闭管都变黄，说明菌株可发酵葡萄糖，例如大肠埃希氏菌。只有开放管变黄而封闭管不变黄，说明菌株为氧化型，例如铜绿假单胞菌。两管均不变黄，则说明菌株不分解葡萄糖或该条件下不产酸，例如粪产碱菌常表现为不分解糖型。

六、典型质控菌株表现

质控菌株的作用是确认培养基配方、灭菌条件、指示剂状态、接种方式和培养条件是否正常。如果质控菌株结果不符合预期，应检查培养基 pH、葡萄糖是否降解、指示剂颜色、石蜡覆盖是否充分、培养温度和菌株状态。

七、O/F 试验与普通糖发酵试验有什么不同？

普通糖发酵试验通常关注细菌是否能够分解某种糖并产酸、产气，而 O/F 试验更关注细菌在有氧和缺氧条件下的糖代谢途径。也就是说，O/F 试验不仅判断“是否分解葡萄糖”，还判断“是氧化分解还是发酵分解”。

这对非发酵革兰氏阴性杆菌鉴定尤其重要。例如铜绿假单胞菌可氧化利用葡萄糖，但不进行典型发酵；而肠杆菌科细菌多为发酵型，能在封闭条件下分解葡萄糖产酸。因此，O/F 试验可帮助区分肠杆菌科细菌和非发酵菌。

八、常见问题与注意事项

首先，接种菌必须为纯培养物。若样品中混有不同菌株，可能出现颜色不一致或难以解释的结果。试验前应先在非选择性平板上纯化，并挑取典型单菌落进行接种。

其次，封闭管的石蜡层必须足够厚。若覆盖不完全或存在气泡，氧气仍可进入培养基，导致封闭管出现假阳性酸化，误判为发酵型。

第三，接种方式应为穿刺接种，不宜用接种环在表面划线。O/F 培养基是半固体培养基，穿刺可使菌体分布于培养基深部，便于观察不同氧环境下的代谢反应。

第四，培养基颜色应在使用前确认。若培养基灭菌后颜色异常、明显偏黄或偏蓝，可能提示 pH 不合适、指示剂异常或灭菌过度，不宜用于正式试验。

第五，结果判读应以颜色变化为主，不宜只看菌体生长浑浊。某些菌株可在培养基中生长，但不分解葡萄糖产酸；也有些菌株生长较弱，但仍可出现局部酸化。因此，应结合开放管、封闭管的颜色变化和质控结果综合判断。

九、小结

O/F 培养基是一种用于鉴别细菌糖代谢方式的半固体生化培养基。通过设置开放管和封闭管，可以判断细菌对葡萄糖的利用是发酵型、氧化型还是不分解糖型。发酵型细菌两管均变黄；氧化型细菌仅开放管变黄；不分解糖型两管通常保持绿色或偏碱性。

该培养基在革兰氏阴性杆菌鉴定中具有重要意义，尤其适用于区分肠杆菌科发酵型细菌和假单胞菌等非发酵菌。实际使用时，应注意纯培养物接种、石蜡封闭、培养基 pH、指示剂颜色和质控菌株结果。只有操作规范、质控合格，O/F 试验结果才具有可靠的鉴定价值。