食品中肺炎克雷伯菌检验：增菌、分离、纯化与鉴定要点

肺炎克雷伯菌，学名 Klebsiella pneumoniae，属于肠杆菌目、克雷伯菌属，是一类革兰氏阴性、无芽孢、无鞭毛的杆菌。该菌广泛存在于自然环境、动物肠道、食品原料、加工环境以及人体相关样本中。近年来，肺炎克雷伯菌因耐药性、高毒力菌株和食品相关污染风险而受到更多关注。国家致病菌识别网也将相关菌株纳入监测和风险评估体系，用于支持流行分析、预警和公共卫生风险研判。

在食品微生物检验中，肺炎克雷伯菌检测通常采用“增菌—选择性分离—纯化—镜检—鉴定”的流程。根据 2023 年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册相关方法，食品样品可先用 PBS 缓冲液增菌，再接种麦康凯平板进行分离，随后挑取典型或可疑菌落至血平板纯化，最后结合革兰染色、生化鉴定或质谱鉴定确认。

一、方法来源与适用范围

该检验程序来源于 ChinaPIN-2022-TZFX019《国家致病菌识别网技术手册 肺炎克雷伯菌》，适用于食品中肺炎克雷伯菌的检验。该方法属于风险监测或实验室检测技术流程，重点在于从食品样品中检出并确认肺炎克雷伯菌。

肺炎克雷伯菌不是传统食品标准中最常见的限量致病菌项目，但在风险监测、特殊食品调查、耐药菌监测和环境污染溯源中具有一定意义。实验室在使用该方法时，应结合检测目的、样品类型和上级监测方案要求执行。

二、常用培养基和试剂

肺炎克雷伯菌检验中常用 PBS 缓冲液、麦康凯培养基和血平板。三者分别对应增菌、初筛分离和纯化观察三个阶段。

麦康凯培养基中含有胆盐和结晶紫，可抑制多数革兰氏阳性菌；乳糖和中性红可帮助观察乳糖发酵情况。肺炎克雷伯菌通常能发酵乳糖，因此在麦康凯平板上多形成淡粉色至粉红色菌落，并呈明显黏液状。

血平板不是强选择性培养基，但营养丰富，适合纯化和观察菌落典型特征。肺炎克雷伯菌在血平板上常形成较大、湿润、黏液状菌落，通常不溶血。

三、样品增菌：提高目标菌检出机会

增菌步骤通常为：以无菌操作取样品 25 g 或 25 mL，加入含 225 mL PBS 缓冲液 的无菌均质袋中，在拍击式均质器上连续均质 1～2 min；也可将样品放入盛有 225 mL PBS 缓冲液的无菌均质杯中，于 8000～10000 r/min 均质 1～2 min。随后于 36℃±1℃培养 8～18 h。

这一过程相当于制备 1:10 样品匀液，并给予细菌一定复苏和增殖时间。对于食品样品而言，目标菌可能数量较低，且受到加工、冷藏、干燥、盐分、酸度或防腐条件影响而处于受损状态。PBS 增菌可帮助细菌恢复活性，提高后续分离检出率。

增菌时间不宜随意缩短或延长。时间过短可能导致目标菌数量不足，分离平板上不易检出；时间过长则可能导致背景菌过度增殖，增加平板挑选难度。实验室应按 SOP 控制培养温度和时间。

四、麦康凯平板分离：观察典型乳糖发酵菌落

增菌后，取 PBS 增菌液划线接种于麦康凯平板，置 36℃±1℃培养 24～48 h，观察平板上生长菌落。

肺炎克雷伯菌在麦康凯培养基上常形成 淡粉色至粉红色、较大、隆起、表面光滑湿润、黏液状菌落。培养 24 h 时，菌落通常边缘较清晰，呈黏液样光泽；培养至 48 h 后，相邻菌落容易融合，形成类似脓汁样或胶黏状区域。

这种黏液性与肺炎克雷伯菌荚膜丰富有关，是其重要形态特征之一。但需要注意，麦康凯平板上的粉红色黏液菌落并不只有肺炎克雷伯菌可形成，部分克雷伯菌属、肠杆菌属或其他乳糖发酵肠杆菌也可能表现相似。因此，麦康凯平板只能用于初筛，不能作为最终鉴定依据。

五、血平板纯化：获得单一培养物

从麦康凯平板上分别挑取 3～5 个典型或可疑菌落，接种至血平板进行纯化，于 36℃±1℃培养 24～48 h。

肺炎克雷伯菌在血平板上通常形成 白色或略透明、较大、湿润、黏液状菌落。培养 48 h 后，菌落容易融合成片，可形成类似胶水样菌苔。一般不溶血，也无特殊气味。

挑取 3～5 个菌落的目的，是提高检出率并避免只挑到非目标相似菌。食品样品背景菌复杂，麦康凯上的可疑菌落可能并非同一种菌，因此多个可疑菌落分别纯化，有助于后续准确鉴定。

纯化平板应观察菌落是否单一。如果同一平板出现两种以上菌落形态，或有污染菌混杂，应重新挑取单菌落纯化后再进行鉴定。未经纯化的混合菌落不宜直接用于生化仪或质谱鉴定。

六、镜检特征：短粗革兰氏阴性杆菌

经革兰氏染色后，肺炎克雷伯菌在显微镜下呈 较短粗的革兰氏阴性杆菌，可单个、成双或短链状排列。细胞大小大致为 0.3～1.5 μm × 0.6～6 μm。该菌无芽孢、无鞭毛，通常不运动。

镜检是鉴定过程中的重要质量控制步骤。若镜下出现革兰氏阳性菌、球菌、真菌或明显混合形态，说明纯化不足或存在污染，不应继续按肺炎克雷伯菌结果报告。镜检结果应与平板菌落形态和后续仪器鉴定相互印证。

七、生化鉴定与质谱鉴定

纯化后的可疑菌株可采用生化鉴定系统进行确认。常见系统包括 VITEK 2 GN 卡、BD Phoenix、API 生化鉴定试剂条等。这些系统可根据糖发酵、酶反应、底物利用和代谢特征综合判断菌种。

目前，微生物质谱鉴定，尤其是 MALDI-TOF MS，也已广泛用于肺炎克雷伯菌鉴定。常见质谱系统通常能较好识别肺炎克雷伯菌，且具有速度快、通量高、操作简便等优点。我国出入境检验检疫体系中也可见 MALDI-TOF MS 法用于出口食品中肺炎克雷伯氏菌快速筛选的相关方法。

需要注意的是，肺炎克雷伯菌与部分近缘克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变栖克雷伯菌等在某些系统中可能存在鉴定接近或数据库依赖问题。对于重要监测菌株、疑似高毒力菌株或耐药风险菌株，必要时可结合分子检测、全基因组测序或耐药基因检测进一步确认。

八、典型结果判断流程

最终结果应以纯化菌株的生化鉴定或质谱鉴定为准，不能仅凭麦康凯或血平板菌落形态判定。

九、操作中的关键质控点

首先，样品均质必须充分。食品样品中的细菌分布可能不均，尤其是固体、粉末、肉制品、即食食品等，若均质不充分，会导致检出结果不稳定。

其次，麦康凯平板不能替代确认鉴定。粉红色黏液菌落只是可疑特征，其他乳糖发酵肠杆菌也可能表现相似。

第三，纯化必须充分。生化仪和质谱仪都要求使用纯培养物，混合菌会导致错误鉴定或低置信度结果。

第四，挑取菌落数量要足够。建议从麦康凯平板挑取 3～5 个典型或可疑菌落，分别纯化鉴定，降低漏检风险。

第五，培养时间要规范。24 h 可观察典型菌落，48 h 可能出现融合现象；若培养过久，菌落形态可能失去参考价值，也增加污染和误判风险。

第六，鉴定结果要结合形态学判断。若质谱或生化结果与菌落形态、革兰染色完全不一致，应复核纯化过程、样本编号和仪器数据库。

十、与培养基质量相关的注意事项

PBS 应无菌、pH 合适、无沉淀或污染。若 PBS 本身污染，会影响增菌和分离结果。麦康凯平板应颜色正常、表面干湿适中、无析水、无污染；培养基选择性和乳糖显色反应应通过质控菌株验证。血平板应新鲜、表面平整、无干裂、无溶血异常和污染。

麦康凯培养基如果选择性不足，背景菌可能过度生长；如果选择性过强或平板过干，目标菌可能生长较弱。血平板若保存不当，可能影响菌落黏液性观察和纯化效果。因此，培养基质量直接影响肺炎克雷伯菌筛选和鉴定准确性。

十一、小结

食品中肺炎克雷伯菌检验通常采用 PBS 增菌、麦康凯平板分离、血平板纯化、革兰染色镜检及生化或质谱鉴定的流程。肺炎克雷伯菌在麦康凯平板上常形成淡粉色、大而隆起、光滑湿润、黏液状菌落；在血平板上形成白色或略透明的大菌落，48 h 后易融合成胶水样菌苔，通常不溶血。

但菌落形态只能作为初筛依据。最终确认必须依赖纯培养物的生化鉴定、质谱鉴定或必要的分子方法。对于食品风险监测和实验室质量控制而言，规范的增菌、充分的纯化、准确的镜检和可靠的鉴定系统，是保证肺炎克雷伯菌检验结果准确的关键。