化妆品中霉菌和酵母菌计数检验方法解析

霉菌和酵母菌是化妆品微生物质量控制中的重要检测对象。与细菌相比，霉菌和酵母菌更容易在部分含水量较高、营养较丰富或防腐体系较弱的产品中存活。一旦产品受到真菌污染，可能导致气味异常、变色、胀气、膏体分层、包装污染，甚至影响消费者使用安全。因此，化妆品中霉菌和酵母菌数的测定，是评价产品卫生状况和防腐体系有效性的重要项目。

根据《化妆品安全技术规范》相关微生物检验方法，霉菌和酵母菌计数通常采用虎红（孟加拉红）培养基倾注平板法。化妆品检样经过处理和稀释后，在规定条件下培养，计算 1 g 或 1 mL 检样中形成的霉菌和酵母菌菌落总数，并以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。

一、方法适用范围与检测原理

该方法适用于化妆品中霉菌和酵母菌数的测定。所谓霉菌和酵母菌数，是指化妆品检样经过处理后，在一定培养基、培养温度和培养时间条件下，能够形成可见菌落的霉菌和酵母菌总数。

需要强调的是，检测结果并不代表样品中所有真菌细胞的绝对数量，而是表示在本方法规定条件下能够生长并形成菌落的真菌数量。某些受损、休眠或受防腐剂抑制的真菌，可能无法在该条件下形成可见菌落，因此结果本质上是“可培养霉菌和酵母菌”的计数。

本方法依据霉菌和酵母菌的培养特性，在虎红培养基上，于 28℃±2℃培养 5 d，观察并计数形成的真菌菌落。虎红培养基可限制部分霉菌菌落过度蔓延，氯霉素或链霉素则用于抑制细菌生长，使真菌菌落更易观察和计数。

二、常用仪器与耗材

霉菌和酵母菌计数所需设备相对基础，但对无菌操作和温度控制要求较高。常用仪器和耗材包括：

操作前应确认平皿、吸管、稀释液和培养基均无菌。恒温培养箱温度应经确认，培养期间应避免频繁开门造成温度波动。

三、虎红（孟加拉红）培养基的组成与作用

虎红培养基，也称孟加拉红培养基，是霉菌和酵母菌计数常用培养基。其配方中含有蛋白胨、葡萄糖、磷酸盐、硫酸镁、琼脂、虎红和抗生素，能够支持真菌生长，同时抑制部分细菌干扰。

制备时，将除虎红外的各成分加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液，分装后经 121℃高压灭菌 20 min。氯霉素可用少量乙醇溶解，过滤除菌后加入培养基中。若无氯霉素，使用时每 1000 mL 培养基可加链霉素 30 mg。

虎红对霉菌菌落扩散具有一定限制作用，使菌落边界相对清晰，便于计数。抗生素的加入则能减少细菌在培养期间快速生长造成的干扰。由于化妆品样品中常含有表面活性剂、防腐剂、油脂和粉体成分，培养基状态和抗菌成分有效性对计数准确性十分重要。

四、样品稀释与接种

样品稀释方法通常参照菌落总数测定中供检样品制备步骤。根据样品形态不同，水溶性液体、油性样品、膏霜、粉类和疏水性样品应采用相应的分散、中和和稀释方式。对于含防腐剂或抑菌成分的产品，应确保样品处理方法能够尽量消除抑菌干扰，否则可能导致计数偏低。

操作时，取 1:10、1:100、1:1000 的检液各 2 mL，分别注入 2 个灭菌平皿，即每个平皿加入 1 mL 检液。随后注入已融化并冷却至 45℃±1℃ 左右的虎红培养基，充分摇匀。培养基温度过高可能损伤真菌细胞，温度过低则容易提前凝固，影响检液和培养基混合。

培养基凝固后，将平板翻转，置 28℃±2℃培养 5 d，观察并记录菌落。另取一个不加检液的灭菌空平皿，加入约 15 mL 虎红培养基，凝固后同条件培养，作为空白对照。

五、为什么要设置空白对照？

空白对照用于判断培养基、平皿、操作环境和倾注过程是否存在污染。若空白对照出现霉菌或酵母菌生长，说明此次实验可能受到外源污染，样品结果的可靠性应重新评估，必要时应重新检测。

空白对照不能简单地从样品计数中“扣除”。因为污染来源、污染菌分布和样品平板中的菌落并不一定一致。对于微生物检验而言，空白对照异常通常提示整个检测过程存在质量问题，应查找原因，如培养基污染、平皿污染、空气沉降污染、操作时间过长或无菌操作不规范。

六、培养与菌落观察

霉菌和酵母菌的生长速度通常比细菌慢，因此培养时间设定为 5 d。培养期间应保持培养箱温度稳定，避免平板表面过度干燥或冷凝水过多。

观察时，应分别记录每个平板上的霉菌和酵母菌菌落数。酵母菌菌落通常较湿润、圆形、边缘整齐，形态类似细菌菌落但生长速度较慢；霉菌菌落常呈绒毛状、絮状、粉状或放射状，可能产生不同颜色的菌丝和孢子。部分霉菌菌落易扩散，若覆盖其他菌落，会影响计数准确性。

必要时可使用放大镜或显微镜辅助区分菌落形态。对于难以判断的菌落，应结合菌落边缘、质地、颜色、是否有菌丝、是否呈酵母样湿润菌落等特征综合判断。

七、计数范围与结果计算

计数时，先点计每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，再求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，应优先选择菌落数在 5 CFU～50 CFU 范围内的平皿计数，乘以相应稀释倍数，即为每 g 或每 mL 检样中所含的霉菌和酵母菌数。

例如，1:100 检液的两个平皿分别计数为 18 CFU 和 22 CFU，平均为 20 CFU，则样品霉菌和酵母菌数为：

20 × 100 = 2000 CFU/g 或 CFU/mL

若各稀释度平板菌落数均不在 5 CFU～50 CFU 范围内，应参照菌落总数报告方法进行报告。例如所有平板菌落数均低于计数范围，可按最低稀释度结果估算；若菌落过多或蔓延严重，应根据实际情况记录，并按实验室 SOP 或标准要求处理。

八、结果报告方式

每 g 或每 mL 化妆品中霉菌和酵母菌数以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。固体、膏霜、粉类等样品通常以 CFU/g 报告；液体样品通常以 CFU/mL 报告。

报告时应注明样品名称、批号、检测方法、稀释度、计数平板、结果单位和必要的异常情况。若空白对照污染、平板蔓延严重、样品抑菌性明显或平行结果差异过大，应在原始记录中说明，并根据实验室质量控制程序判断是否需要复检。

九、常见问题与注意事项

第一，样品必须充分分散。化妆品基质复杂，膏霜、油性样品和粉类样品容易分散不均，若混匀不足，会导致平行平板差异较大。

第二，培养基温度应控制在 45℃±1℃左右。温度过高可能损伤霉菌和酵母菌，温度过低会提前凝固，造成菌落分布不均。

第三，抗生素加入方式要合适。氯霉素通常不宜直接与培养基一起高压灭菌，应按方法要求溶解、过滤后加入，避免有效性下降。

第四，虎红培养基应避免强光长时间照射。虎红为染料类成分，光照可能影响培养基颜色和性能，制备后应按要求保存。

第五，培养时间应足够。霉菌和酵母菌生长较慢，过早读数可能漏计小菌落；但培养过久也可能导致霉菌蔓延，影响计数。

第六，不能把所有小菌落都简单当作酵母菌。部分细菌在抗生素作用不足或样品背景复杂时也可能形成小菌落，必要时应结合形态和镜检判断。

十、培养基质量对检测结果的影响

霉菌和酵母菌计数结果高度依赖培养基性能。虎红培养基应能支持常见霉菌和酵母菌生长，同时有效抑制细菌干扰，并适度限制霉菌蔓延。若培养基营养不足、pH 异常、抗生素失效、虎红浓度不当或琼脂凝胶状态不佳，都可能影响结果。

对于培养基生产和使用实验室，应关注以下质量要点：培养基外观是否均一，凝胶强度是否适宜，灭菌后颜色是否正常，pH 是否符合要求，空白培养是否无菌，质控菌株是否表现出预期生长。对于即用型平板，还应关注水分、表面干湿度、有效期和储存条件。

十一、小结

化妆品中霉菌和酵母菌计数检验，主要用于评价产品受真菌污染程度及一般卫生状况。该方法以虎红培养基为基础，通过 28℃±2℃培养 5 d，计数样品中可形成菌落的霉菌和酵母菌数量。

操作关键在于样品充分稀释和分散、培养基温度控制、空白对照合格、培养时间充足以及正确选择 5 CFU～50 CFU 范围内的平板计数。结果以 CFU/g 或 CFU/mL 报告。对于含防腐剂、油脂或表面活性剂较多的化妆品，还应特别关注样品处理和抑菌中和效果，避免因真菌受抑制而导致假低结果。

霉菌和酵母菌计数不仅是一个检测项目，也是评价化妆品生产卫生、包装控制、防腐体系和产品稳定性的重要参考。规范使用虎红培养基和严格执行无菌操作，是获得可靠检测结果的基础。