地衣芽孢杆菌检验标准操作程序解析：热处理、平板计数与鉴定要点

地衣芽孢杆菌，学名 Bacillus licheniformis，是一类常见的芽孢杆菌，广泛存在于土壤、植物表面、饲料和多种生物产品中。由于其能形成耐热芽孢，并具有较强环境耐受性，常被用于微生态制剂、饲料添加剂、发酵产品及部分功能性微生物产品中。在产品质量控制中，地衣芽孢杆菌检验既要确认是否存在目标菌，也要在需要时进行定量计数，以评价产品活菌含量和批次稳定性。

依据 GB/T 34224—2017《生物产品中功能性微生物检测》，地衣芽孢杆菌检验通常采用“样品制备—系列稀释—80℃热处理—营养琼脂平板涂布培养—特征菌落计数—纯培养—形态学鉴定—生化鉴定—结果计算与报告”的流程。该方法的核心特点是加入 80℃±1℃、10 min 热处理步骤，利用芽孢耐热性降低非芽孢菌干扰，提高目标芽孢杆菌检出的选择性。

一、方法原理与检测思路

地衣芽孢杆菌属于芽孢杆菌类群，能形成椭圆形芽孢。芽孢对热、干燥和不良环境有较强抵抗力，因此在检测时可通过适当热处理杀灭或抑制部分非芽孢细菌，而保留芽孢杆菌的存活能力。随后将处理后的样品稀释液涂布于营养琼脂平板，在适宜温度下培养，形成可计数菌落。

需要注意的是，营养琼脂上的白色、不透明、湿润、边缘光滑菌落只是可疑特征，并不能直接等同于地衣芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌等近缘芽孢杆菌在形态和普通生化反应上可能相似。因此，本方法采用“特征菌落计数 + 挑取鉴定 + 按确认比例换算”的方式，减少误计风险。

二、主要设备与材料

除微生物实验室常规灭菌、接种和培养设备外，地衣芽孢杆菌检验还需要恒温培养箱、80℃恒温水浴箱、均质器、振荡器、无菌吸管或移液器、无菌培养皿、显微镜和 pH 检测工具等。

原资料中提到“37℃±1℃厌氧培养箱中培养”，这一表述不宜机械沿用。地衣芽孢杆菌通常为需氧或兼性厌氧芽孢杆菌，常规检验可按标准或实验室 SOP 规定的培养条件执行；若采用厌氧培养或改变培养条件，应经过方法适用性确认。

三、培养基和试剂的作用

地衣芽孢杆菌检验常用营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、无菌生理盐水、革兰氏染色液和细菌生化鉴定试剂盒。

营养琼脂属于非选择性基础培养基，能支持多种细菌生长。因此，80℃热处理和后续鉴定非常重要。若样品中存在多种芽孢杆菌，仅凭营养琼脂菌落形态无法可靠区分目标菌。

四、样品制备：获得均匀的 1:10 样品匀液

固体和半固体样品取 25 g，置于含 225 mL 无菌生理盐水 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；也可置于含 225 mL 无菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。

液体样品应先充分摇匀，再用无菌吸管吸取 25 mL，加入装有 225 mL 无菌生理盐水 的无菌锥形瓶中。锥形瓶内可预置适量无菌玻璃珠，充分振摇后制成 1:10 样品匀液。

样品制备必须充分均匀。功能性微生物产品中芽孢可能吸附在载体、粉末、颗粒或保护剂中，如果均质不足，会导致平板菌落数波动较大，影响结果准确性。

五、系列稀释与热处理

用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 无菌生理盐水 的无菌试管中。注意吸管尖端不要触及稀释液面，随后振摇试管或用新的无菌吸管反复吹打混匀，制成 1:100 样品匀液。

继续进行 10 倍递增稀释时，每递增一次稀释都应更换新的无菌吸管或吸头，防止高浓度样品带入低浓度稀释管，造成计数偏高。

根据对样品菌含量的估计，选择 2～3 个连续适宜稀释度，将每个稀释度置 80℃±1℃水浴维持 10 min。热处理的目的是利用芽孢耐热性，降低非芽孢细菌或营养细胞的干扰。水浴温度和时间必须准确，温度不足会降低选择性，温度过高或时间过长则可能损伤目标芽孢，导致计数偏低。

六、平板接种与培养

热处理后，吸取菌液 0.2 mL 接种于营养琼脂平板表面，用无菌涂布棒小心、快速、均匀地将接种液涂布于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种 2 个平板。

涂布后，将平板静置约 10 min，使接种物完全被培养基吸收。随后翻转平皿，置 37℃±1℃培养 48h±2h。

涂布平板时，平板表面应干湿适宜。若表面过湿，菌液易流动，形成融合菌落；若表面过干，则可能影响芽孢萌发和菌落形成。培养期间应避免频繁移动平板，以免影响菌落分布。

七、特征菌落计数

培养结束后，选择特征菌落数在 20 CFU～200 CFU 之间、且无蔓延菌落生长的平板进行计数。低于 20 CFU 的平板记录具体菌落数；大于 200 CFU 的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若其中一个平板有较大片状菌落生长，该平板不宜采用，可用无片状菌落生长的平板作为该稀释度菌落数。若片状菌落不到平板面积的一半，而其余一半菌落分布均匀，可计算未受影响半个平板后乘以 2，代表该平板菌落数，但应在原始记录中注明。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，可将每条单链作为一个菌落计数。地衣芽孢杆菌在营养琼脂上的可疑特征菌落通常为 白色、不透明、湿润、边缘光滑。但芽孢杆菌属内菌落形态相近，仍需挑取菌落进行鉴定确认。

八、菌落挑选、纯培养与鉴定

1. 菌落挑选和纯培养

从平板上挑选 5 个白色、不透明、湿润、边缘光滑的可疑菌落，分别转入营养肉汤培养基中，于 37℃±1℃培养 24h±2h，随后进行形态学和生化鉴定。

挑取多个菌落是为了提高代表性。若平板上出现多种可疑菌落形态，应选择不同类型菌落分别确认，避免只挑取最典型菌落而造成结果偏差。

2. 形态学鉴定

取纯培养物进行革兰氏染色并镜检。地衣芽孢杆菌通常为 革兰氏阳性杆菌，呈杆状，长度约 1.5 μm～3.5 μm，可单个、成对或短链状排列。其芽孢为椭圆形，多为中生或近中生，芽孢囊通常不明显膨大。

需要注意，培养时间、菌龄和染色条件会影响革兰染色表现。部分芽孢杆菌在老龄培养物中可能出现革兰染色不稳定，因此建议使用新鲜纯培养物进行镜检。

3. 生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行确认。地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌群内其他近缘菌种在形态和部分生化反应上相似，必要时可结合商品化鉴定系统、MALDI-TOF MS、16S rRNA、gyrB、gyrA 等分子方法进行复核。

若形态学和生化鉴定结果均符合地衣芽孢杆菌特征，可判定为地衣芽孢杆菌；若结果不一致，应重新纯化后复测。

九、目标菌数量如何计算？

由于平板上的特征菌落不一定全部为地衣芽孢杆菌，需要根据挑取鉴定结果计算每块平板上的目标菌数量。计算公式为：

a = b / A × C

其中，a 为每块平板上的地衣芽孢杆菌菌落数；b 为挑取后经证实为地衣芽孢杆菌的菌落数；A 为挑取平板上用于验证的菌落数；C 为平板上的所有特征菌落数。

例如，某平板上共有 100 个特征菌落，挑取 5 个进行鉴定，其中 4 个确认为地衣芽孢杆菌，则该平板中目标菌数量为：

a = 4 / 5 × 100 = 80 CFU

若只有一个稀释度平板菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中地衣芽孢杆菌菌落数的平均值，再根据稀释倍数和接种体积换算为每克或每毫升样品中的菌落总数。

若两个连续稀释度平板菌落数均在适宜计数范围内，应按加权公式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；ΣC 为纳入计算平板的地衣芽孢杆菌菌落数之和；n₁ 为第一稀释度，即低稀释倍数平板个数；n₂ 为第二稀释度，即高稀释倍数平板个数；d 为第一稀释度稀释因子。

需要特别注意，本方法每皿涂布量为 0.2 mL。若公式中的 d 未包含接种体积校正，实验室在换算 CFU/g 或 CFU/mL 时应明确加入相应体积校正系数，避免低估结果。

十、结果判定与报告

若样品菌落符合地衣芽孢杆菌形态学及生化鉴定特征，可判定为地衣芽孢杆菌。

定性报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出地衣芽孢杆菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出地衣芽孢杆菌。

定量报告时，菌落数小于 100 CFU 时，以整数报告；菌落数大于或等于 100 CFU 时，对第 3 位数字进行修约后保留前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式表示，采用两位有效数字。例如 12600 CFU/g 可报告为 1.3×10⁴ CFU/g。

十一、常见问题与注意事项

第一，80℃热处理是本方法的重要选择步骤，不能省略或随意改变。温度和时间不准确会影响非目标菌抑制效果和目标菌回收率。

第二，营养琼脂上的白色湿润菌落只是可疑菌落，不能直接报告为地衣芽孢杆菌，必须经过形态学和生化鉴定确认。

第三，地衣芽孢杆菌通常按需氧或普通培养条件理解，不宜简单写作厌氧培养箱。若使用厌氧条件或改变培养条件，应经过验证。

第四，本法每皿涂布量为 0.2 mL，最终结果换算时应考虑接种体积。

第五，原公式应清楚写作 N=ΣC/[(n₁+0.1n₂)×d]，避免因括号和乘除关系不明导致计算错误。

第六，样品制备必须充分均质。芽孢可吸附于载体、粉末或颗粒中，混匀不足会导致平行性差。

第七，芽孢杆菌近缘种鉴定难度较高。若生化结果不典型或用途要求较高，建议结合分子或质谱方法复核。

第八，平板蔓延或链状生长会影响计数，应按方法规则处理，并在原始记录中注明。

十二、小结

地衣芽孢杆菌检验是生物产品中功能性芽孢杆菌质量控制的重要内容。该方法以无菌生理盐水制备样品匀液，经系列稀释后进行 80℃±1℃、10 min 热处理，再取 0.2 mL 涂布于营养琼脂平板，于 37℃±1℃培养 48h±2h，选择 20 CFU～200 CFU 的特征菌落平板进行计数，并挑取可疑菌落进行营养肉汤纯培养、革兰染色镜检和生化鉴定。

该方法的关键在于：样品制备充分、热处理条件准确、涂布均匀、培养条件合适、特征菌落经鉴定确认后再换算目标菌数量。对于地衣芽孢杆菌这类芽孢杆菌检测而言，单纯依靠菌落形态并不可靠，必须结合芽孢形态、生化鉴定和必要的复核方法，才能保证检测结果准确可信。