枯草芽孢杆菌检验标准操作程序解析：热处理、平板计数与鉴定要点

枯草芽孢杆菌，学名 Bacillus subtilis，是一类常见的产芽孢革兰氏阳性杆菌，广泛存在于土壤、植物表面、饲料原料、发酵产品和多种生物制品中。由于其能形成耐受性较强的芽孢，并具有一定产酶、抗逆和环境适应能力，常被用于微生态制剂、饲料添加剂、生物肥料、发酵工业和功能性微生物产品中。因此，在相关产品质量控制中，枯草芽孢杆菌检验既要关注是否检出目标菌，也要在需要时进行活菌计数。

依据 GB/T 34224—2017《生物产品中功能性微生物检测》，枯草芽孢杆菌检验通常采用“样品制备—系列稀释—80℃热处理—营养琼脂平板涂布培养—特征菌落计数—纯培养—形态学鉴定—生化鉴定—结果计算与报告”的流程。该方法的核心特点是通过 80℃±1℃、10 min 热处理 利用芽孢耐热性筛选芽孢杆菌，再通过形态学和生化鉴定确认目标菌身份。

一、方法原理与检测思路

枯草芽孢杆菌能够形成芽孢，芽孢对热、干燥和不良环境具有较强抵抗力。检测时，对样品稀释液进行 80℃热处理，可减少部分非芽孢细菌或营养细胞的干扰，使芽孢杆菌更容易在平板上形成可计数菌落。

不过，营养琼脂并不是枯草芽孢杆菌专属选择性培养基。地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等近缘芽孢杆菌，也可能在营养琼脂上形成相似菌落。因此，本方法不能只看“表面粗糙、不透明、灰色或微黄色”的菌落形态，而应挑取特征菌落进行纯培养、革兰染色镜检和生化鉴定，再按确认比例换算目标菌数量。

二、主要设备与材料

除微生物实验室常规灭菌、接种和培养设备外，枯草芽孢杆菌检验还需要恒温培养箱、80℃恒温水浴箱、均质器、振荡器、无菌吸管或移液器、无菌培养皿、显微镜和 pH 检测工具等。

原资料中使用“恒温厌氧培养箱”表述，实际应用中应谨慎。枯草芽孢杆菌通常按需氧或普通培养条件进行平板培养；若实验室采用厌氧培养或改变培养条件，应进行方法适用性确认，确保目标菌回收率和典型性符合要求。

三、培养基和试剂的作用

枯草芽孢杆菌检验常用营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、无菌生理盐水、革兰氏染色液和细菌生化鉴定试剂盒。

营养琼脂属于基础培养基，选择性有限。因此，80℃热处理和后续鉴定是本方法保证结果可靠性的关键。若样品中含有多种芽孢杆菌，仅凭营养琼脂菌落形态很难准确区分目标菌。

四、样品制备：获得均匀的 1:10 样品匀液

固体和半固体样品取 25 g，置于含 225 mL 无菌生理盐水 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；也可置于含 225 mL 无菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。

液体样品应先充分摇匀，再用无菌吸管吸取 25 mL，加入装有 225 mL 无菌生理盐水 的无菌锥形瓶中。锥形瓶内可预置适量无菌玻璃珠，充分振摇后制成 1:10 样品匀液。

样品制备的关键是充分分散。功能性微生物产品常含粉末载体、保护剂、蛋白原料或颗粒状物质，芽孢可能吸附在颗粒表面。如果样品均质不足，会导致平行平板差异较大，影响计数准确性。

五、系列稀释与 80℃热处理

用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 无菌生理盐水 的无菌试管中。注意吸管尖端不要触及稀释液面，随后振摇试管或用新的无菌吸管反复吹打混匀，制成 1:100 样品匀液。

继续进行 10 倍递增稀释时，每递增一次稀释都应更换新的无菌吸管或吸头，避免高浓度样品带入低浓度稀释管，造成计数偏高。

根据对样品菌含量的估计，选择 2～3 个连续适宜稀释度，将每个稀释度置 80℃±1℃水浴维持 10 min。热处理的目的，是利用芽孢耐热性降低非芽孢菌干扰。温度和时间必须准确控制，温度不足会降低选择性，温度过高或时间过长则可能损伤目标芽孢，导致结果偏低。

六、平板接种与培养

热处理后，吸取菌液 0.2 mL 接种于营养琼脂平板表面，用无菌涂布棒小心、快速、均匀地涂布于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种 2 个平板。

涂布后，将平板静置约 10 min，使接种物完全被培养基吸收。随后翻转平皿，置 37℃±1℃培养 48h±2h。

平板表面应干湿适宜。表面过湿时，菌液容易流动，形成融合菌落；表面过干时，可能影响芽孢萌发和菌落形成。培养期间应减少频繁移动平板，避免菌落分布受影响。

七、特征菌落计数

培养结束后，选择特征菌落数在 20 CFU～200 CFU 之间、且无蔓延菌落生长的平板进行计数。低于 20 CFU 的平板记录具体菌落数；大于 200 CFU 的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若其中一个平板有较大片状菌落生长，该平板不宜采用，可用无片状菌落生长的平板作为该稀释度菌落数。若片状菌落不到平板面积的一半，而其余一半菌落分布均匀，可计算未受影响半个平板后乘以 2，代表该平板菌落数，并在原始记录中注明。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，可将每条单链作为一个菌落计数。枯草芽孢杆菌在营养琼脂上的可疑特征菌落通常为 表面粗糙、不透明、灰色或微黄色。但这些特征并不专属于枯草芽孢杆菌，必须进行后续确认。

八、菌落挑选、纯培养与鉴定

1. 菌落挑选和纯培养

从平板上挑选 5 个表面粗糙、不透明、灰色或微黄色的可疑菌落，分别转入营养肉汤培养基中，于 37℃±1℃培养 24h±2h，随后进行形态学和生化鉴定。

挑取多个菌落有助于提高代表性。如果平板上可疑菌落形态不一致，应挑取不同形态菌落分别确认，避免只挑取最典型菌落造成结果偏差。

2. 形态学鉴定

取纯培养物进行革兰氏染色并镜检。枯草芽孢杆菌通常为 革兰氏阳性杆菌，呈杆状，两端圆，长度约 1.5 μm～3.0 μm，无荚膜，可具周生鞭毛，能形成芽孢。芽孢多为椭圆形，中生或近中生，芽孢囊通常不明显膨大。

需要注意，芽孢杆菌在培养时间较长或菌龄较老时，革兰染色可能出现不稳定，部分细胞可呈革兰阴性样表现。因此，形态学鉴定建议使用新鲜纯培养物，并结合芽孢形态和生化鉴定结果综合判断。

3. 生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行确认。枯草芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌群内其他近缘种在菌落形态、芽孢位置和部分生化反应上可能相似。若生化结果不典型，或产品用途对菌种准确性要求较高，可结合 MALDI-TOF MS、16S rRNA、gyrA、gyrB 等分子方法进行复核。

若形态学和生化鉴定结果均符合枯草芽孢杆菌特征，可判定为枯草芽孢杆菌；若结果不一致，应重新纯化后复测。

九、目标菌数量如何计算？

由于平板上的特征菌落不一定全部为枯草芽孢杆菌，需要根据挑取鉴定结果计算每块平板中的目标菌数量。计算公式为：

a = b / A × C

其中，a 为每块平板上的枯草芽孢杆菌菌落数；b 为挑取后经证实为枯草芽孢杆菌的菌落数；A 为挑取平板上用于验证的菌落数；C 为平板上的所有特征菌落数。

例如，某平板上共有 100 个特征菌落，挑取 5 个进行鉴定，其中 4 个确认为枯草芽孢杆菌，则该平板中目标菌数量为：

a = 4 / 5 × 100 = 80 CFU

若只有一个稀释度平板菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中枯草芽孢杆菌菌落数的平均值，再根据稀释倍数和接种体积换算为每克或每毫升样品中的菌落总数。

若两个连续稀释度平板菌落数均在适宜计数范围内，应按加权公式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；ΣC 为纳入计算平板的枯草芽孢杆菌菌落数之和；n₁ 为第一稀释度，即低稀释倍数平板个数；n₂ 为第二稀释度，即高稀释倍数平板个数；d 为第一稀释度稀释因子。

需要特别注意，本方法每皿涂布量为 0.2 mL。若公式中的 d 未包含接种体积校正，实验室在换算 CFU/g 或 CFU/mL 时应明确加入相应体积校正系数，避免低估结果。

十、结果判定与报告

若样品菌落符合枯草芽孢杆菌形态学及生化鉴定特征，可判定为枯草芽孢杆菌。

定性报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出枯草芽孢杆菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出枯草芽孢杆菌。

定量报告时，菌落数小于 100 CFU 时，以整数报告；菌落数大于或等于 100 CFU 时，对第 3 位数字进行修约后保留前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式表示，采用两位有效数字。例如 12600 CFU/g 可报告为 1.3×10⁴ CFU/g。

十一、常见问题与注意事项

第一，80℃热处理是本方法的重要选择步骤，不能省略或随意改变。温度和时间不准确会影响非目标菌抑制效果和目标菌回收率。

第二，营养琼脂上的粗糙、灰色或微黄色菌落只是可疑菌落，不能直接报告为枯草芽孢杆菌，必须经过形态学和生化鉴定确认。

第三，枯草芽孢杆菌常规培养应按需氧或普通培养条件理解，不宜简单写作厌氧培养箱。若采用特殊培养条件，应经过验证。

第四，本法每皿涂布量为 0.2 mL，最终结果换算时应考虑接种体积。

第五，加权公式应清楚写作 N=ΣC/[(n₁+0.1n₂)×d]，避免因括号和乘除关系不明导致计算错误。

第六，样品必须充分均质。芽孢可吸附于载体、粉末或颗粒中，混匀不足会导致平行性差。

第七，枯草芽孢杆菌群近缘种鉴定难度较高。若生化结果不典型或产品用途要求较高，建议结合质谱或分子方法复核。

第八，平板蔓延、片状生长或链状生长会影响计数，应按方法规则处理，并在原始记录中注明。

十二、小结

枯草芽孢杆菌检验是生物产品中功能性芽孢杆菌质量控制的重要内容。该方法以无菌生理盐水制备样品匀液，经系列稀释后进行 80℃±1℃、10 min 热处理，再取 0.2 mL 涂布于营养琼脂平板，于 37℃±1℃培养48h±2h，选择 20 CFU～200 CFU 的特征菌落平板进行计数，并挑取可疑菌落进行营养肉汤纯培养、革兰染色镜检和生化鉴定。

该方法的关键在于：样品制备充分、热处理条件准确、涂布均匀、培养条件合适、特征菌落经鉴定确认后再换算目标菌数量。对于枯草芽孢杆菌这类芽孢杆菌检测而言，单纯依靠菌落形态并不可靠，必须结合芽孢形态、生化鉴定和必要的复核方法，才能保证检测结果准确可信。