弯曲菌检验标准操作程序解析：微需氧培养、滤膜分离与PCR鉴定

弯曲菌是一类重要的食源性致病菌，常见于禽肉、畜肉及其加工环境中，其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌与人类胃肠炎关系最为密切。弯曲菌对氧气、温度、干燥和冷冻较敏感，但在禽类肠道、胴体表面和肉类漂洗液中较常见。因此，弯曲菌检验的关键不是简单划线培养，而是要控制好样品保存、微需氧环境、选择性增菌、滤膜分离和菌株确认。

本操作程序来源于 GB 4789.9—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》以及 2020 年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册相关 SOP，检测对象包括空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、结肠弯曲菌（Campylobacter coli）、海鸥弯曲菌（Campylobacter lari）、乌普萨拉弯曲菌（Campylobacter upsaliensis）和胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus）。该方法适用于生禽肉和生畜肉中弯曲菌的定性检验，也包括平板计数法用于定量评估。

一、方法特点：弯曲菌为什么“难培养”？

弯曲菌对培养条件要求较高，最典型的特点是需要 微需氧环境，常用气体比例为 5% O₂、10% CO₂、85% N₂。氧气过高会抑制其生长，完全厌氧也不适合其生长。多数食品相关弯曲菌在 42℃±1℃ 微需氧条件下生长较好，这与其在禽类肠道环境中的适应性有关。

弯曲菌细胞较脆弱，对干燥、低温损伤和氧暴露敏感。因此，样品采集后应尽快检测；如不能现场接种，应低温保存于 4℃～7℃，但避免直接接触冰块，并尽快送达实验室。样品运输和前处理不当，可能导致弯曲菌受损或死亡，从而造成假阴性。

二、主要设备与培养基

弯曲菌检验除常规微生物设备外，还需要微需氧培养装置、42℃培养设备、相差显微镜、离心机、PCR 仪和电泳系统等。

Preston 肉汤常用于选择性增菌，mCCD、Karmali、Skirrow 和 Preston 琼脂用于选择性分离。不同选择性平板对背景菌抑制能力和目标菌恢复能力存在差异，因此 SOP 中常采用两类平板组合，提高检出率。

三、第一法：定性检验流程

1. 样品处理

禽胴体可整只放入合适容积的无菌自封袋中，加入 Preston 肉汤淹没样品，比例为每 1 kg 样品加入 500 mL Preston 肉汤。置振荡器上以 100 r/min 振荡15 min，或反复揉搓禽胴体 5 min，确保脖子、胸、腿、肛门等部位均被充分漂洗。取出禽胴体后，漂洗液用于弯曲菌检测。

分割禽肉或畜肉取一块大于 100 g 的样品，加入适量 Preston 肉汤淹没样品，同样以 100 r/min 振荡15 min。若同时检测多个项目，可先从不同部位剪取部分肉和皮用于其他项目，剩余样品再按上述方法漂洗后取漂洗液检测弯曲菌。

弯曲菌常分布于胴体表面、皮肤、肠道污染部位和肉块表面，因此漂洗法比单点取样更能反映样品表面污染情况。

2. 微需氧增菌

微需氧环境可通过三种方式建立：

样品漂洗液在微需氧条件下，置 42℃±1℃ 振荡培养或静置培养 24h±2h。振荡速度可为 25 r/min～100 r/min。培养时瓶盖应旋松或用无菌牛皮纸包扎瓶口，以利于气体交换。

四、滤膜分离培养：为什么要用滤膜？

弯曲菌具有细小、弯曲且运动性较强的特点。滤膜分离法利用孔径 0.45 μm～0.6 μm 的无菌滤膜，使弯曲菌较容易穿过滤膜到达选择性平板表面，而部分较大的背景菌被阻留，从而提高分离效果。

将 Karmali 或 mCCD 琼脂平板，以及 Preston 或 Skirrow 琼脂平板在 42℃±1℃ 烘干表面水分。将滤膜轻轻贴在平板中央，避免气泡和空隙。取 200 μL～250 μL 24 h 增菌液滴加在滤膜上，室温静置 45 min～60 min。待液体完全透过滤膜后，用无菌镊子轻轻揭下滤膜并弃去，翻转平板，在 42℃±1℃微需氧条件下培养48h±2h。

滤膜法的关键是平板表面不能过湿，滤膜必须与平板充分贴合，静置时间要足够。若滤膜下有空隙或液体未完全透过，可能影响菌落形成和分离效果。

五、不同选择性平板上的可疑菌落

弯曲菌在不同选择性平板上的菌落形态略有差异，且同一平板上也可能出现两种典型形态。

经过滤膜过滤培养后，平板上出现的菌落多数为较纯的弯曲菌样菌落，但仍需进行后续鉴定。菌落形态受培养基批次、湿度、菌龄、样品背景菌和微需氧条件影响，不能作为唯一判定依据。

六、弯曲菌属鉴定

挑取可疑菌落 2～3 个 接种到哥伦比亚琼脂平板上，在 42℃微需氧条件下培养24h±2h，随后进行弯曲菌属鉴定。

弯曲菌属鉴定主要包括形态观察、动力观察、氧化酶试验、25℃微需氧生长试验和 42℃有氧生长试验。

形态观察时，革兰氏染色复染推荐使用 0.5% 苯酚品红溶液。弯曲菌菌体较细，普通染色观察有时不够清晰。动力观察可将可疑菌落悬浮于布氏肉汤中，用相差显微镜观察。

需要注意，有些弯曲菌株形态不典型，运动也可能不明显。若样品经过冷藏、氧暴露或培养时间过长，菌体可能变为球状或退化形态，应结合其他鉴定结果综合判断。

七、空肠、结肠、海鸥和乌普萨拉弯曲菌的鉴定

确定为弯曲菌属后，可通过过氧化氢酶、马尿酸盐水解和吲哚乙酸酯水解等试验区分常见种。

马尿酸盐水解试验是区分空肠弯曲菌的重要项目。操作时需挑取较大量菌落，加入 0.4 mL 1%马尿酸钠中混匀，36℃±1℃温育后加入茚三酮溶液。出现深紫色为阳性，淡紫色或无明显变化判为阴性。

吲哚乙酸酯水解试验可使用纸片法。挑取较大量菌落至吲哚乙酸酯纸片上，滴加灭菌蒸馏水，若 5 min～10 min 内出现深蓝色为阳性。若无颜色变化则为阴性。

也可使用经过验证的生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统替代上述单项试验。

八、PCR鉴定：可选但很有价值

PCR 可作为弯曲菌属及不同种的快速确认方法。模板 DNA 可用煮沸法制备：挑取少量菌苔加入 200 μL 无菌超纯水中，制成肉眼可见微混浊菌悬液，100℃水浴 10 min，13000×g 离心 2 min，取上清作为 DNA 模板。

该 SOP 中 PCR 可同时检测弯曲菌属及五种目标菌，常用目标基因和片段大小如下：

PCR 反应体系总体积为 25 μL，扩增程序为：95℃预变性 6 min；95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，共 30 个循环；72℃延伸 7 min。电泳时，取 10 μL PCR 产物与 2 μL 6×Loading Buffer混匀后加样，按约 5 V/cm 电泳 30 min～40 min。与阳性、阴性和空白对照比较，出现相应目的条带即可判定对应目标阳性。

PCR 检测应严格分区操作，避免扩增产物污染。PCR 结果可提高鉴定效率，但若用于正式报告，应符合实验室验证和方法要求。

九、结果报告：定性检验

综合分离培养、弯曲菌属鉴定、种水平鉴定或 PCR 结果进行报告。若检出对应目标菌，可报告样品中检出空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌或胎儿弯曲菌。

若无可疑菌落，或可疑菌落经鉴定后不属于上述目标菌，则报告未检出相应弯曲菌。若同一样品中检出多种弯曲菌，应分别报告。

十、第二法：平板计数法

平板计数法适用于定量评估样品中弯曲菌数量，常用于污染水平调查、风险评估和过程控制。

1. 样品处理与稀释

禽胴体按每 1 kg 样品加入 500 mL 缓冲蛋白胨水的比例进行漂洗，100 r/min 振荡 15 min，或反复揉搓 5 min，漂洗液作为原液。分割肉块同样按比例加入缓冲蛋白胨水，振荡后取漂洗液作为原液。

吸取漂洗液，按 10 倍系列稀释制备样品匀液。每递增一次稀释，应更换新的无菌吸管或吸头，防止交叉带菌。

2. 接种与培养

根据样品污染水平，选择 2～3 个适宜稀释度，通常为原液、10倍、100倍或1000倍稀释液。每个稀释度取 100 μL，立即涂布于 Karmali 选择性琼脂平板，每个稀释度做 2 个平行平板，于 42℃±1℃微需氧环境培养48h±2h。

3. 计数范围与可疑菌落确认

选择平均可疑菌落数在 15 CFU～150 CFU/板的稀释度计数。如果所有稀释度均不在该范围内，则选择最接近 15 或 150 且菌落分离度好的平板。若所有稀释度均大于 150 CFU/板，则选择稀释倍数最大、菌落分离度较好的平板计数。

从同一稀释度的两块平板上共挑取至少 5 个可疑菌落进行纯化和鉴定；若可疑菌落不足 5 个，则全部挑取。若最高稀释度平板平均菌落数大于 50 CFU/板，挑取鉴定菌落数可为平均菌落数的 10%，最多 10 个菌落。

十一、定量结果计算

平板计数法并不是把所有可疑菌落都直接计为弯曲菌，而是根据鉴定阳性率进行校正。

计算公式为：

每块平板上弯曲菌实际菌落数 = 两块平板可疑菌落数平均数 ×（鉴定为弯曲菌的阳性菌落数 / 挑取的可疑菌落数）

例如，同一稀释度两块 Karmali 平板上分别有 100 CFU 和 85 CFU 可疑菌落，挑取 5 个可疑菌落鉴定，其中 4 个为弯曲菌，则阳性率为 80%。该稀释度下弯曲菌实际菌落数为：

(100+85)/2 × 80% = 74 CFU

若该结果来自 10⁻¹ 稀释度，每板涂布量为 0.1 mL，且样品按 1 kg 加 500 mL 缓冲蛋白胨水漂洗，则换算时需同时考虑稀释倍数、接种体积和漂洗液体积与样品重量比例。可按 SOP 示例理解为：

弯曲菌数量（CFU/g）= 74 × 10 × (1/0.1) × (500/1000)

其中，74 为平板校正后的平均菌落数；10 为 10⁻¹ 稀释度对应稀释倍数；0.1 为每平板涂布体积，单位 mL；500/1000 为 500 mL 漂洗液对应 1 kg 样品。

报告时，小于 100 CFU 的结果按四舍五入原则以整数报告；大于或等于 100 CFU 时，以 10 的指数形式表示，保留 2 位有效数字，单位为 CFU/g。

若平板上均无可疑菌落，则按方法规定以小于最低检出限的形式报告。原文“以小于 1 乘以最低稀释倍数乘以 5 报告”可理解为结合最低稀释度、涂布量和漂洗比例计算方法检出限。

十二、菌株保存与运输

经过鉴定的菌株可纯化于哥伦比亚琼脂平板，在 42℃±1℃微需氧环境培养18 h～24 h 后，用无菌棉拭子将平板菌苔全部擦拭，并均匀悬浮于弯曲菌保存培养基中。冻存管先于 4℃放置 30 min，再置 -80℃冻存。

菌株运输前，从 -80℃取出冻存管，挑取少许冻存液划线接种于哥伦比亚琼脂平板，在 42℃±1℃微需氧环境培养 48 h 后，刮取菌苔转种于含 5%裂解羊血的弯曲菌运输半固体培养基中，拧紧管盖，置于装有冰块的保温装置中运输，运输时间不宜超过 48 h。

弯曲菌对氧气和环境变化敏感，保存和运输过程中要尽量减少氧暴露和反复冻融，保证菌株活性。

十三、常见问题与注意事项

第一，弯曲菌不是普通需氧菌，必须建立有效微需氧环境。产气袋容积应与培养罐匹配，三气培养箱应确认气体比例稳定。

第二，样品应尽快检测，低温保存仅用于短时间运输，且应避免样品直接接触冰块。

第三，滤膜分离时，滤膜与平板之间不能有空隙，静置时间应保证增菌液完全透过滤膜。

第四，Karmali、mCCD、Skirrow、Preston 平板上的可疑菌落不能直接报告，必须经形态、动力、氧化酶和生长特性确认。

第五，弯曲菌形态可能不典型，老龄培养物可能呈球状或退化形态，建议使用新鲜纯培养物鉴定。

第六，马尿酸盐水解试验需要足够菌量，否则空肠弯曲菌可能出现假阴性。

第七，PCR 检测应设置阳性、阴性和空白对照，避免污染或扩增失败导致错误判断。

第八，定量计数时必须根据鉴定阳性率校正可疑菌落数，不能把所有可疑菌落都直接计为弯曲菌。

十四、小结

弯曲菌检验是一项对培养条件要求较高的食品微生物检测方法。定性检验通常采用 Preston 肉汤微需氧增菌，再通过滤膜法接种 Karmali、mCCD、Skirrow 或 Preston 选择性平板，挑取可疑菌落后进行弯曲菌属鉴定和种水平鉴定。平板计数法则以漂洗液为原液，直接涂布 Karmali 平板，根据可疑菌落计数和鉴定阳性率计算样品中弯曲菌数量。

该方法的关键控制点包括：样品及时低温送检、微需氧条件准确、选择性平板质量合格、滤膜操作规范、可疑菌落必须纯化鉴定、定量结果需按阳性率和接种体积校正。对于生禽肉和生畜肉中弯曲菌监测而言，规范执行这些步骤，是获得可靠检出率和准确定量结果的基础。