细菌回复突变试验仪器和试剂（一）：基础培养基与菌株鉴定试剂

细菌回复突变试验，又称Ames试验，是食品安全性毒理学评价中常用的遗传毒性初筛方法。该试验利用组氨酸或色氨酸营养缺陷型菌株，观察受试物是否能诱导回复突变，从而判断其是否具有诱发点突变的潜力。要获得可靠结果，除了菌株本身要符合要求，仪器设备、培养基、溶媒和鉴定试剂也必须规范制备和质量控制。

GB 15193.4-2014《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》中，对仪器和试剂提出了基本要求。本文主要解读Ames试验中常用仪器、营养肉汤、底层培养基、顶层培养基、抗生素平板、组氨酸-生物素平板和DMSO等试剂的用途与制备要点。

一、Ames试验常用仪器

细菌回复突变试验涉及菌株复苏、培养基制备、无菌操作、低温保存、代谢活化系统制备和恒温培养等环节，因此需要配备常规微生物实验设备和部分低温、无菌处理设备。

其中，生物安全柜、灭菌设备和恒温培养设备对结果可靠性影响很大。若无菌操作不规范，可能导致平板污染；若培养温度偏差较大，可能影响背景菌苔和回变菌落数；若顶层琼脂温度过高，则可能损伤试验菌株。

二、营养肉汤培养基：用于菌株增菌

营养肉汤培养基用于试验菌株的增菌培养，使菌株达到适宜浓度和活性。Ames试验通常要求使用新鲜增菌液，因为菌液活性直接影响背景菌苔、自发回变数和阳性对照反应。

制备时，将各成分加蒸馏水溶解，调pH至7.4，分装后在0.103 MPa条件下灭菌20 min，4℃保存备用，保存期一般不超过半年。使用前应检查是否澄清、无沉淀、无污染。

三、营养肉汤琼脂培养基：用于菌株鉴定和培养

营养肉汤琼脂培养基是在营养肉汤基础上加入琼脂制成的固体培养基，常用于菌株划线、抗性鉴定、结晶紫敏感性试验等。

制备时加热融化，调pH至7.4，在0.103 MPa条件下灭菌20 min。该培养基本身不用于正式回变菌落计数，而主要服务于菌株复苏和特性鉴定。

四、底层培养基：Ames试验的基础平板

底层培养基是Ames试验中承载顶层琼脂和回变菌落生长的基础平板。它通常由1.5%琼脂培养基、Vogel-Bonner minimal medium E磷酸盐贮备液和葡萄糖溶液组成，是限制性基础培养基。其营养水平较低，只有发生回复突变的菌株才能在平板上形成可见菌落。

底层培养基常按以下方式制备：在400 mL灭菌的1.5%琼脂培养基中，依次加入50倍磷酸盐贮备液8 mL和40%葡萄糖溶液20 mL，充分混匀。冷却至约80℃时，按90 mm平皿每皿约25 mL倒制平板。凝固后倒置于37℃培养箱中放置24 h备用。

底层平板应表面平整、无气泡、无污染、干湿适中。平板过湿会导致菌落扩散或顶层琼脂不均匀；平板过干可能影响菌株恢复和菌落形成。

五、Vogel-Bonner磷酸盐贮备液与葡萄糖溶液

Vogel-Bonner minimal medium E磷酸盐贮备液为Ames试验底层培养基提供缓冲体系和基本无机盐。其配制时应注意硫酸镁的加入顺序，待其他试剂完全溶解后，再缓慢加入硫酸镁继续溶解，否则容易析出沉淀。

40%葡萄糖溶液由葡萄糖40.0 g加蒸馏水至100 mL制成。由于葡萄糖高温下容易发生降解或焦糖化，标准中采用较低压力条件灭菌。制备后应避免反复高温处理，并注意无菌保存。

六、顶层培养基：让菌株和受试物均匀分布

顶层培养基是Ames试验中与菌液、受试物和S9混合液直接接触的半固体体系。它通常含少量琼脂、氯化钠以及微量组氨酸-生物素。少量组氨酸允许试验菌株进行有限分裂，形成背景菌苔；若细胞发生回复突变，则可继续生长形成回变菌落。

使用时，每100 mL顶层琼脂加入10 mL 0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液，混匀后分装。正式试验时融化顶层培养基，每管分装2 mL，并置45℃水浴中保温。温度过高可能损伤菌株，温度过低则容易凝固，影响混匀和倾注。

七、组氨酸-生物素溶液：为什么只加“微量”？

Ames试验菌株为营养缺陷型，不能在缺乏组氨酸或生物素的环境中持续生长。顶层培养基中加入微量组氨酸-生物素，是为了让所有菌体经历少数几次分裂，形成可观察的背景菌苔，同时为诱变过程提供必要的细胞分裂机会。

诱变试验用0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液可按以下方式配制：D-生物素30.5 mg和L-组氨酸19.4 mg，加蒸馏水至250 mL，0.103 MPa灭菌20 min。该溶液不宜随意提高浓度，否则可能导致非回复突变细胞也过度生长，影响回变菌落判读。

八、菌株鉴定用特殊试剂

除正式试验用培养基外，Ames试验还需要一系列菌株鉴定试剂，用于确认菌株的抗性、营养缺陷和膜屏障特征。

其中，氨苄青霉素和四环素类试剂不宜高温灭菌，应无菌配制或过滤除菌。抗生素平板制备时，应待底层培养基冷却至适宜温度后加入已灭菌或无菌制备的成分，避免抗生素失活。

九、主平板和鉴定平板的作用

氨苄青霉素平板用于TA97、TA98、TA100等带有抗性因子的菌株主平板保存；氨苄青霉素-四环素平板用于TA102等具有四环素抗性的菌株。主平板的作用是短期维持菌株状态，便于日常接种和复苏，但不能长期替代深低温保存。

每1000 mL抗生素平板可由底层培养基、组氨酸水溶液、生物素溶液、氨苄青霉素溶液组成；四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加入。各成分应分别灭菌或无菌制备后混合。

组氨酸-生物素平板则用于组氨酸需求试验。通过比较菌株在含组氨酸和不含组氨酸培养基上的生长情况，可确认其是否仍保持组氨酸缺陷型特征。若菌株在不含组氨酸培养基上出现明显菌膜生长，说明菌株特性可能异常，不宜继续用于正式试验。

十、DMSO的使用注意事项

二甲亚砜，即DMSO，是Ames试验中常用的有机溶媒，适合溶解许多水不溶性受试物和阳性诱变剂。标准资料中要求DMSO应为光谱纯、无菌。由于DMSO具有较强溶解能力，容易携带溶解物进入细胞，也可能在较高体积下影响菌株或S9体系，因此每皿加入量应严格控制。

使用DMSO作为受试物溶媒时，应设置DMSO溶媒对照；若阳性诱变剂使用DMSO溶解，而受试物不用DMSO，也应设置相应DMSO对照，以便正确解释阳性对照体系。

十一、试剂质量控制与保存建议

Ames试验对试剂质量非常敏感。培养基成分或试剂除特殊说明外，至少应达到化学纯要求，并应确认无诱变性。葡萄糖、组氨酸、生物素、抗生素和DMSO等试剂应按要求保存，避免反复冻融、反复高温处理或长时间暴露。

实验室应建立培养基和试剂批记录，内容包括试剂名称、生产厂家、批号、配制日期、灭菌条件、pH、保存条件、有效期、无菌性检查和功能性验证结果。对于Ames试验这类对质量控制要求较高的毒理学试验，培养基和试剂记录不完整会直接影响结果可追溯性。

小结

细菌回复突变试验的仪器和试剂是保证试验可靠性的基础。营养肉汤用于菌株增菌，营养肉汤琼脂用于菌株鉴定和培养，底层培养基提供限制性生长环境，顶层培养基使菌株、受试物和S9体系均匀接触，组氨酸-生物素溶液则帮助形成背景菌苔并支持诱变过程。

对于实验室而言，关键控制点包括：仪器温度和无菌条件稳定，培养基pH和灭菌条件合格，顶层琼脂温度适宜，抗生素和DMSO等试剂质量可靠，所有培养基和试剂均有批号和保存记录。只有基础试剂体系稳定，Ames试验的菌落计数和结果评价才具有可信度。