空肠弯曲菌检验操作步骤：样品处理、增菌与分离培养要点

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是常见食源性致病菌之一，常与禽肉、水产品、乳制品、生鲜食品和交叉污染有关。它与多数常规食品微生物不同，对氧气较敏感，生长需要微需氧环境，同时对培养温度、样品处理方式和增菌体系要求较高。因此，空肠弯曲菌检验的关键，不只是“接种培养”，而是要根据不同食品基质选择合适的前处理方式，并在微需氧条件下完成预增菌、增菌和分离培养。

GB 4789.9-2014规定了食品中空肠弯曲菌的检验方法，其操作流程包括样品处理、Bolton肉汤预增菌与增菌、选择性平板分离、可疑菌落观察以及后续鉴定。需要注意的是，GB 4789.9已有2025版更新，现行标准已将结肠弯曲菌纳入检验范围。本文主要围绕2014版操作思路进行科普解读，实际检测和报告应以现行有效标准为准。

一、为什么空肠弯曲菌检验要重视样品处理？

空肠弯曲菌在食品中的污染水平往往较低，且容易受到氧气、干燥、冷冻、加热和竞争菌群的影响。不同食品基质中，目标菌的分布状态也不同：禽类样品可能存在于体表或腔内冲洗液中；贝类样品可能存在于内容物中；乳制品中脂肪和蛋白质会干扰富集；水样中目标菌数量可能很低，需要通过滤膜浓缩。因此，不同样品不能简单套用同一种前处理方法。

样品处理的目的主要有三个：一是尽可能释放或浓缩样品中的目标菌；二是减少大颗粒、油脂或杂质对培养的干扰；三是让目标菌进入适合恢复和增殖的Bolton肉汤体系中。对于空肠弯曲菌这类对环境较敏感的细菌，样品处理越规范，后续增菌和分离的成功率越高。

二、不同样品的处理原则

GB 4789.9-2014根据食品类型给出了不同处理方式。一般食品通常按25 g或25 mL样品加入225 mL Bolton肉汤进行处理；水果、蔬菜和水产品的取样量为50 g。整禽、贝类、蛋制品、乳制品、表面涂拭样品和水样则需要采用更有针对性的处理流程。

从这些处理方式可以看出，空肠弯曲菌检测并不是所有样品都“取25 g加225 mL”即可。对污染水平低、基质复杂或目标菌分布不均的样品，需要通过冲洗、均质、过滤、离心、稀释或pH调整等方式提高检出率。

三、Bolton肉汤的作用：恢复损伤菌并抑制背景菌

Bolton肉汤是空肠弯曲菌检验中的重要选择性增菌培养基。样品进入Bolton肉汤后，目标菌在微需氧环境下恢复和增殖，同时培养基中的选择性成分对部分背景菌起到抑制作用。对于冷藏、冷冻、加工或运输过程中受损的弯曲菌，预增菌阶段尤为重要。

2014版流程中，样品处理液先在微需氧条件下36 ℃±1 ℃培养4 h，条件允许时可配合约100 r/min振荡。随后必要时测定增菌液pH，并调整至7.4±0.2，再于42 ℃±1 ℃继续培养24 h～48 h。前期较低温度有利于受损菌恢复，后期较高温度则有利于嗜热弯曲菌的选择性增殖。

需要注意的是，弯曲菌需要微需氧环境，不适合普通有氧培养。若气体环境不合格，即使培养基配方正确，也可能导致目标菌不生长或生长很弱。

四、为什么要同时接种24 h和48 h增菌液？

分离步骤中，需将24 h增菌液、48 h增菌液及其对应的1:50稀释液分别划线接种于Skirrow血琼脂和mCCDA琼脂平板。这样设计的目的，是兼顾不同样品中目标菌的恢复速度和背景菌影响。

有些样品中空肠弯曲菌数量较低或受损较重，24 h时可能尚未充分增殖，48 h增菌有助于提高检出机会。但如果增菌时间过长，背景菌也可能增加，影响平板分离。因此，同时接种24 h和48 h增菌液，并设置1:50稀释液，有助于获得更分散、更易观察的可疑菌落。

五、选择性分离培养基：Skirrow血琼脂与mCCDA琼脂

2014版流程中，分离培养主要使用Skirrow血琼脂和mCCDA琼脂，也可选择空肠弯曲菌显色培养基作为补充。不同培养基的选择性成分和显色/菌落表现不同，联合使用可以提高分离效果。

平板划线后，应在微需氧条件下42 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。观察时既要看菌落颜色、形态、光泽和扩散趋势，也要注意背景菌生长情况。若背景菌过多，可能提示选择性不足、样品基质干扰较强、增菌时间偏长或平板状态不佳。

六、可疑菌落如何观察？

mCCDA平板上的可疑空肠弯曲菌菌落通常呈淡灰色，有金属光泽，表面潮湿、扁平，并有沿琼脂表面扩散的趋势。Skirrow血琼脂上的可疑菌落可分为两类：一类为灰色、扁平、湿润有光泽，沿接种线向外扩散；另一类为分散凸起的单个菌落，边缘较整齐、表面发亮。

需要注意的是，菌落形态会受培养时间、培养基批次、平板含水量、微需氧条件、样品背景菌和菌株状态影响。可疑菌落外观只能作为初筛依据，不能直接作为最终确认结果。后续仍需转种纯化，并进行形态观察、动力观察、氧化酶试验、生长条件试验和生化鉴定。

七、微需氧条件是整个流程的关键

空肠弯曲菌对氧气敏感，检验全过程中多次要求微需氧培养，包括增菌和分离培养。常见微需氧条件可通过微需氧产气袋、专用气体混合系统或微需氧培养装置实现。无论采用哪种方式，都应确保气体环境稳定，否则会影响目标菌恢复和菌落形成。

微需氧条件不稳定时，常见问题包括：增菌液目标菌数量不足、分离平板无典型菌落、菌落变小、形态不典型或生化反应偏弱。对于培养结果异常的样品，应优先检查微需氧系统、培养温度、培养基有效性和阳性对照表现。

八、操作中的常见风险点

空肠弯曲菌检验流程较长，涉及样品均质、过滤、离心、增菌、稀释、划线和微需氧培养，任何环节偏差都可能影响结果。

九、与培养基质量控制的关系

空肠弯曲菌检验对培养基质量要求较高。Bolton肉汤既要支持受损弯曲菌恢复，又要有适度选择性；Skirrow血琼脂和mCCDA琼脂既要抑制背景菌，又不能过度抑制目标菌。若培养基选择性过强，可能导致目标菌生长不良；若选择性不足，则背景菌过多，影响可疑菌落观察。

对于培养基生产和使用实验室，应重点关注以下项目：培养基pH、灭菌或加热条件、抗生素补充剂加入温度、血液或添加剂质量、平板含水量、无菌性、促生长能力、选择性和批间一致性。质控菌株应按标准或实验室SOP进行验证，以确保培养基能支持目标菌典型生长。

十、现行标准变化提示

GB 4789.9-2014主要针对食品中空肠弯曲菌的检验。新版GB 4789.9-2025的标准名称已调整为“食品微生物学检验 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验”，适用范围扩展至食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检验。对于实验室而言，这意味着检验流程、培养基和试剂、鉴定方法、报告范围等均应根据现行标准进行更新。

因此，如果企业或实验室仍沿用2014版流程，应及时核对标准更新内容，特别是结肠弯曲菌的纳入、鉴定方法的变化，以及是否增加分子生物学或质谱确认方法。知识库文章可保留2014版操作流程作为历史解读，但实际检测应以现行有效标准为准。

小结

空肠弯曲菌检验的基本流程包括样品处理、Bolton肉汤预增菌与增菌、选择性平板分离和可疑菌落观察。不同样品类型处理方式不同，核心目的都是尽可能释放、浓缩和恢复目标菌，同时降低复杂基质和背景菌干扰。Bolton肉汤增菌、mCCDA琼脂和Skirrow血琼脂分离、微需氧培养条件，是2014版流程中的关键环节。

实际工作中，应特别关注样品代表性、微需氧环境、增菌液pH、培养基选择性、平板状态和可疑菌落后续鉴定。随着GB 4789.9-2025实施，食品中弯曲菌检验已从单纯空肠弯曲菌扩展为空肠弯曲菌和结肠弯曲菌，实验室应及时更新标准文件、培养基体系和结果报告要求。