巧克力琼脂基础培养基：用于嗜血杆菌、奈瑟菌等苛养菌培养的富营养培养基

一、产品用途与基本信息

二、配方组成、用量及作用

三、培养基原理

巧克力琼脂的核心是“基础营养 + 加热溶血 + 生长因子释放”。胰酪蛋白胨、蛋白胨和肝浸出粉提供氨基酸、短肽、维生素和矿物质，为细菌生长提供基础营养。无菌脱纤维羊血加入后，经85 ℃水浴加热，可使红细胞裂解，释放血红素类X因子和NAD类V因子，这些因子对流感嗜血杆菌等嗜血杆菌属细菌尤其重要。

血液加热裂解后，培养基颜色由红色逐渐转为棕褐色，即形成“巧克力色”。与普通血琼脂相比，巧克力琼脂中的红细胞已经被裂解，营养因子更容易释放到培养基中，因此更适合嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等苛养菌生长。部分苛养菌还需要较高湿度和5% CO₂环境，因此质控和实际培养时应注意培养气氛。

需要强调的是，巧克力琼脂基础培养基为非选择性富营养培养基。它可以支持多种苛养菌生长，但不能仅凭菌落在巧克力琼脂上生长就确认菌种，也不能用于药敏结果判读。若需要选择性分离奈瑟菌或其他目标菌，应使用相应选择性巧克力琼脂或添加抗菌选择剂的培养基。

四、使用方法

称取本品34.5 g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装后于121 ℃高压灭菌15 min。灭菌结束后冷却至45～50 ℃，加入7%～10%无菌脱纤维羊血，混匀后置85 ℃水浴中加热10～15 min，并不停轻轻摇动，直至培养基颜色变成均匀棕褐色。随后冷却至约50 ℃，倾注无菌平板，凝固后备用。

制备时应注意温度控制。加入羊血时基础培养基温度过高，可能导致血液成分过度破坏；温度过低则不利于混匀和后续溶血。85 ℃水浴加热时应持续轻轻摇动，使红细胞均匀裂解，避免局部过热、血液结块或培养基颜色不均。倒板时应避免产生气泡和过厚或过薄的平板。

五、质量控制

注：原资料中“特异性”更适合修正为“生长支持能力”。巧克力琼脂是富营养培养基，不是特异性鉴别培养基，质控重点在于能否支持苛养菌良好生长。

六、结果观察与应用提示

流感嗜血杆菌在巧克力琼脂上通常形成较小、湿润、灰白色至半透明菌落；脑膜炎奈瑟菌可形成灰白色、湿润、圆形菌落。菌落大小和形态会受到培养时间、CO₂浓度、平板湿度、血液质量和培养基制备状态影响。若目标菌生长弱，应首先检查CO₂培养条件和巧克力琼脂制备质量。

巧克力琼脂不用于观察溶血。由于红细胞已经裂解，平板呈棕褐色，不能像血琼脂那样判断α、β或γ溶血。它也不用于药敏鉴定，药敏试验应使用标准规定的药敏培养基和方法。若在巧克力琼脂上获得疑似菌落，应进一步进行革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定、质谱鉴定或分子检测等确认。

七、与血琼脂的区别

巧克力琼脂和血琼脂都需要加入血液，但两者制备方式和用途不同。血琼脂中红细胞基本保持完整，可用于观察溶血；巧克力琼脂中红细胞经加热裂解，释放营养因子，更适合苛养菌生长，但不能用于溶血判读。

因此，巧克力琼脂更适合作为苛养菌培养基，而不是溶血鉴别培养基。

八、常见问题与原因分析

若巧克力琼脂平板颜色偏红，可能是红细胞裂解不充分，X因子和V因子释放不足，可能影响嗜血杆菌生长。应检查85 ℃水浴时间、摇动是否充分、血液加入比例和水浴温度是否准确。若颜色过深、出现焦化味或大量沉淀，可能是加热过度或局部过热，可能导致营养因子破坏。

若流感嗜血杆菌或脑膜炎奈瑟菌质控生长不良，应检查羊血质量、加血比例、加热溶血程度、CO₂浓度、培养湿度、培养温度、菌株活性和培养基pH。奈瑟菌对干燥、温度变化和培养气氛较敏感，平板过干或CO₂不足都会影响生长。

若平板表面水分过多，可能导致菌落扩散或污染风险增加；若平板过干，则会影响苛养菌恢复。倒板后应在适宜条件下干燥至表面无明显水膜，但避免过度干燥。若平板中出现血块或颜色不均，说明血液混匀或加热过程不充分，应重新制备。

九、应用边界与注意事项

巧克力琼脂基础培养基适合用于苛养菌培养，但不具有鉴别功能。它不能根据颜色变化判断特定代谢反应，也不能用于药敏试验结果判读。若检测样品背景菌较多，普通巧克力琼脂可能出现杂菌生长，应根据检测目的选用选择性添加剂或选择性巧克力琼脂。

对于嗜血杆菌和奈瑟菌等对环境较敏感的菌株，平板制备质量和培养条件非常关键。建议使用新鲜制备或经验证保存期限内的平板，培养时保持适宜湿度和5% CO₂环境。若用于科研或质控，应严格记录羊血批号、加血比例、加热时间、pH和质控结果。

十、贮存、废物处理与注意事项

本品不得用于临床检验。干粉培养基使用后应立即密封，置于避光、干燥处保存，避免吸潮、结块和性能下降。称量时应注意粉尘防护，建议佩戴口罩并在通风良好的环境中操作。未开封产品在规定条件下保质期为三年；开封后受储存湿度、温度和使用频次影响，保质时间可能缩短。

制备后的巧克力琼脂平板含有血液成分，应按实验室验证条件保存，并在规定期限内使用。若出现污染、异味、明显干裂、水膜过多、血块、颜色异常或质控结果不符合要求，应停止使用并排查原因。检测后的带菌平板、接触样品的耗材和剩余培养物，应置于121 ℃高压灭菌30 min后，再按实验室生物安全要求处理。

参考资料

巧克力琼脂基础培养基产品说明。

嗜血杆菌、奈瑟菌等苛养菌培养和巧克力琼脂制备相关微生物学资料。

X因子、V因子与嗜血杆菌培养需求相关资料。