葡萄糖叠氮盐肉汤与Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂检测肠球菌

肠球菌是一类耐受性较强的革兰氏阳性球菌，常存在于人和动物肠道、食品、水体及加工环境中。在食品和环境卫生检测中，肠球菌常被作为粪便污染、卫生状况和加工控制效果的指示菌之一。与大肠菌群相比，肠球菌对干燥、盐分、热处理和环境压力的耐受性较强，因此在某些样品中具有较好的卫生指示意义。

葡萄糖叠氮盐肉汤和Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂是传统肠球菌检测体系中常见的选择性培养基。前者多用于多管发酵或MPN检测，适合检出样品中少量肠球菌；后者可用于倾注平板计数，适合对一定污染水平的样品进行菌落计数和可疑菌筛选。

一、检测原理：利用肠球菌对叠氮钠的耐受性

肠球菌通常能够耐受一定浓度的叠氮钠，而许多革兰氏阴性菌会受到叠氮钠抑制。因此，在培养基中加入叠氮钠，可提高对肠球菌或粪便链球菌类群的选择性。葡萄糖作为可发酵碳源，肠球菌生长并发酵葡萄糖产酸，可使培养基出现酸性反应。

Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂则同时利用结晶紫和叠氮钠的选择性抑制作用，抑制部分非目标菌生长，并通过血液成分和菌落形态辅助识别可疑菌落。需要注意，选择性培养基上的可疑菌落只能作为初筛结果，最终仍需通过纯培养、形态观察、革兰氏染色及必要的确认试验判断。

二、葡萄糖叠氮盐肉汤：适合少量肠球菌的MPN检测

葡萄糖叠氮盐肉汤常用于多管技术，可检测食品中存在数量较少的肠球菌。操作时，无菌移取1 mL样品稀释液加入盛有葡萄糖叠氮盐肉汤的试管中，每个稀释度通常接种3管或5管。对于低污染样品，可将10 mL或100 mL最低稀释度样品液加入等体积双料培养基中，每个稀释度同样接种3管～5管。

接种后的葡萄糖叠氮盐肉汤于35 ℃培养72 h，检查产酸情况，并记录阳性管数。这里的阳性管主要指产酸管，说明样品中可能存在能够在该选择性培养基中生长并发酵葡萄糖的目标或疑似目标菌。

多管法的优点是灵敏度较高，适合目标菌数量较低或样品基质复杂的情况；缺点是培养时间较长，且结果需进一步确认，不能只凭初发酵产酸直接报告肠球菌阳性。

三、45 ℃复筛：区分阳性与可疑反应

从35 ℃培养后产酸的阳性管中，移取一环培养物接种至新鲜配制的单料葡萄糖叠氮盐肉汤中，每管约5 mL。随后置45 ℃水浴培养48 h，并分别在18 h和48 h观察产酸情况。

若45 ℃培养18 h内产酸，通常提示有肠球菌存在；若18 h后至48 h内才产酸，则可报告为可疑肠球菌，需要结合后续确认结果判断。旧资料中同一句“18 h内产酸”重复出现，发布时应删去重复句并按上述逻辑表述。

45 ℃复筛利用的是肠球菌相对较强的耐热生长能力。但温度、接种量和培养基状态都会影响产酸时间，因此不能把该结果作为唯一判定依据。

四、显微镜观察：快速辅助确认形态

对阳性或可疑阳性培养物进行显微镜观察，可快速判断是否存在短链状或成对排列的革兰氏阳性球菌。肠球菌通常为革兰氏阳性球菌，可呈单个、成对或短链排列，不形成芽胞。

镜检只能作为快速辅助确认，不能替代选择性分离和生化鉴定。若镜检发现大量革兰氏阴性杆菌、芽胞杆菌或形态明显不符的菌体，应考虑污染或非目标菌干扰。

五、MPN结果报告：根据阳性管数组合查表

多管法最终可根据不同稀释度的阳性管数组合查最大可能数表，即MPN表，估算样品中肠球菌数量。报告时应注明样品量、稀释度、每个稀释度接种管数、阳性管数组合和结果单位。

MPN结果是统计估算值，不是直接计数值。其准确性取决于稀释度选择是否合适、接种量是否准确、阳性判定是否可靠和确认试验是否充分。

六、Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂：用于倾注平板计数

Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂适用于倾注平板计数。操作时，准备两套平板，各加入系列稀释的样品悬液1 mL。每个平板再加入约15 mL已熔化并冷却至45 ℃左右的Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂，轻轻混匀。琼脂凝固后，置35 ℃培养3 d。

培养后，紫色小菌落可作为可疑肠球菌菌落进行计数。由于选择性培养基上仍可能有少量非目标菌生长，因此可疑菌落计数后应挑取典型菌落进一步确认。

培养基温度过高可能损伤菌体，过低则容易提前凝固，导致菌落分布不均。倾注法还应注意样品悬液与培养基充分混匀，否则容易造成平板内菌落分布不均，影响计数准确性。

七、Barnes乙酸亚铊四唑葡萄糖琼脂确认

将Packer平板上的可疑肠球菌典型菌落划线转接至Barnes乙酸亚铊四唑葡萄糖琼脂培养基上，35 ℃培养24 h后观察。旧资料描述中，粪肠球菌相关典型菌落中心可呈红色，可有或无白色边缘；其他D群链球菌可表现为白色或桃红色菌落。

需要注意，传统资料中的“粪球菌”“D族链球菌”属于早期分类和方法学语境。现代微生物分类中，肠球菌已从链球菌属中独立出来，因此文章发布时宜表述为“肠球菌及相关粪便链球菌类群的确认”，避免把所有D群链球菌都直接等同于现代肠球菌。

若结果用于正式检测或质量判定，应根据所执行标准进行完整确认，而不应只凭菌落颜色报告。

八、两种方法如何选择？

葡萄糖叠氮盐肉汤多管法更适合样品中目标菌数量较少、需要提高检出概率或进行MPN估算的场景；Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂倾注法更适合污染水平相对较高、希望直接获得可疑菌落计数的样品。

在实际应用中，两个方法可作为不同检测目的的选择，而不是简单互相替代。若样品背景菌复杂或结果接近限值，应加强确认试验和质控。

九、常见问题与控制建议

十、培养基质量与安全注意事项

这类方法涉及叠氮钠、结晶紫、乙酸亚铊及血液成分等特殊成分。叠氮钠和乙酸亚铊均具有毒性，配制、称量、废液处理和废弃培养物处置应按实验室安全要求进行。含叠氮钠废液不应随意倒入金属管道，避免形成危险残留物。

培养基质量控制方面，葡萄糖叠氮盐肉汤应重点检查pH、产酸指示能力、选择性和促生长能力；Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂应关注血液质量、选择性抑制效果、菌落颜色和批间一致性；Barnes培养基应验证典型菌落显色和目标菌生长情况。

对于培养基生产和使用实验室，叠氮钠类选择性培养基应特别关注抑制性与促生长能力的平衡。抑制性不足会造成背景菌过多，抑制性过强则可能影响目标肠球菌恢复和检出。

小结

葡萄糖叠氮盐肉汤和Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂是传统肠球菌检测中的两类重要培养基。葡萄糖叠氮盐肉汤适合多管法和MPN估算，可用于检测食品或其他样品中少量肠球菌；Packer结晶紫-叠氮钠血琼脂适合倾注平板计数，紫色小菌落可作为可疑肠球菌菌落进行计数。

实际检测中，初筛阳性不能直接等同于肠球菌检出。应结合45 ℃复筛、显微镜观察、革兰氏染色、确认培养基及必要的生化鉴定进行综合判断。同时，应重视叠氮钠、乙酸亚铊等危险试剂的安全管理，以及培养基选择性、促生长能力和批间一致性质量控制。