大肠菌群和大肠埃希氏菌菌落计数：平板法、干燥复水膜法与滤膜法

大肠菌群和大肠埃希氏菌是食品、水质和环境卫生检测中常见的卫生指示菌。大肠菌群反映样品受到肠道来源或环境卫生污染的可能性；大肠埃希氏菌则与粪便污染指示关系更密切。二者名称相近，但检测意义和确认方法并不完全相同。

在实际检验中，大肠菌群常采用紫红胆盐乳糖琼脂平板计数法、MPN法或测试片法；大肠埃希氏菌可采用选择性显色体系、干燥复水膜、滤膜法或标准规定的确认程序进行计数。不同方法适用于不同样品类型和污染水平，不能简单互相替代。

一、大肠菌群与大肠埃希氏菌有什么区别？

大肠菌群是一类在一定条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞杆菌。它不是单一菌种，而是一类指示菌群，可能包括埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、柠檬酸杆菌属等。

大肠埃希氏菌是大肠菌群中的一个重要成员。食品中检出大肠埃希氏菌，通常更直接提示粪便污染或卫生控制不足。需要注意的是，不能把“大肠菌群阳性”直接等同于“大肠埃希氏菌阳性”，也不能把所有深红色或产气菌落都直接报告为大肠埃希氏菌。

二、平板计数法：紫红胆盐乳糖琼脂的作用

传统大肠菌群平板计数常使用紫红胆盐乳糖琼脂，简称VRBA或VRBL。该培养基含有乳糖、胆盐、结晶紫和酸碱指示成分。胆盐和结晶紫可抑制部分革兰氏阳性菌；乳糖用于观察发酵反应；能发酵乳糖产酸的菌落通常呈红色至深红色，并可在菌落周围形成胆盐沉淀。

操作时，通常准备平行平板。每个平板加入适宜稀释度的样品液1 mL，再加入约15 mL已熔化并冷却至45 ℃左右的紫红胆盐乳糖琼脂，充分混匀。待培养基凝固后，再覆盖约5 mL同种琼脂培养基。凝固后翻转平板，按标准规定温度和时间培养后计数。

覆盖一层琼脂的目的，是限制菌落蔓延，并使厌氧或微需氧条件下的乳糖发酵反应更稳定，有利于典型菌落和胆盐沉淀的形成。

三、VRBA平板上的典型菌落如何识别？

在紫红胆盐乳糖琼脂上，大肠菌群典型菌落通常为红色至深红色，菌落直径约0.5 mm或稍大，菌落周围可见胆盐沉淀环。若多个菌落长在一起，菌落可能变小，沉淀环也可能不清晰。

需要注意，典型菌落只是“大肠菌群可疑菌落”，并不等于最终确认。部分非目标菌或食品基质成分也可能导致类似颜色和沉淀反应。

四、为什么低稀释度样品容易出现假阳性？

原资料提到，如果食品中含有较多碳水化合物但不含乳糖，当低稀释度样品加入培养基时，可能造成异常结果。这是因为样品本身的糖类、酸性成分、色素、脂肪、蛋白或颗粒物可能影响培养基颜色、菌落形态和沉淀环形成，尤其在高浓度样品中更明显。

因此，对10⁻²或更低稀释度的平板，若出现可疑大肠菌群菌落，建议进行确认。可挑取可疑菌落转接至乳糖肉汤、麦康凯肉汤或现行标准规定的确认培养基中，观察产酸、产气及相关生化特征。

五、大肠菌群确认：不能只看平板颜色

紫红胆盐乳糖琼脂可用于初筛和计数，但对部分样品和低稀释度平板，应对典型或可疑菌落进行验证。传统资料中提到可转接乳糖肉汤或麦康凯肉汤，在35 ℃培养后验证，也可用Eijkman试验验证大肠埃希氏菌存在。需要注意，Eijkman试验属于较早用于耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌推定的试验思路，现行正式检验应按有效食品安全国家标准或实验室认可方法执行。

六、干燥复水膜计数法：操作简便、读数直观

干燥复水膜是一类预制化、商品化的计数系统。用于大肠菌群和大肠埃希氏菌计数的复水膜通常以紫红胆盐类营养体系为基础，并加入显色底物。部分产品添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸等底物，用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶活性。

在这类计数膜上，大肠埃希氏菌常表现为蓝色菌落，并伴随气泡；大肠菌群则可表现为红色或蓝色并伴有产气反应。气泡提示乳糖或相关底物发酵产气，蓝色反应通常与β-葡萄糖醛酸苷酶活性有关。

干燥复水膜的优势是操作简便、节省空间、读数相对直观，适合常规样品筛查和批量检测。但不同品牌和型号的底物体系、培养条件和判读规则可能不同，使用时必须严格按说明书和标准要求执行。

七、干燥复水膜法的局限性

虽然干燥复水膜法使用方便，但并非没有局限。首先，并非所有大肠埃希氏菌都表现为典型蓝色反应，少数菌株可能β-葡萄糖醛酸苷酶阴性。其次，少数非大肠埃希氏菌也可能出现类似酶反应或产气表现。再次，食品样品中的颗粒、色素、脂肪或高背景菌可能影响读数。

因此，复水膜结果用于正式报告时，应确认该产品适用于相应样品和检测目的。若结果异常、接近限值或用于争议样品，应按标准方法或确认程序复核。

八、滤膜法：适合水样和大体积低污染样品

滤膜法是将一定体积样品通过无菌滤膜过滤，使微生物截留在膜表面，再将滤膜转移到选择性培养基上培养和计数。该方法常用于饮用水、瓶装水、清洁水样或其他低浊度、低污染水平样品。

滤膜法的优点是可以处理较大体积样品，提高低水平污染的检出能力；缺点是对样品澄清度要求较高。如果样品浑浊、含脂肪、含颗粒或黏稠，滤膜容易堵塞，不适合直接过滤。

滤膜法可结合不同选择性培养基检测大肠菌群或大肠埃希氏菌。正式检测时，应按对应水质、食品或产品标准选择培养基、温度、时间和报告单位。

九、三种计数方法如何选择？

如果检测对象是食品大肠菌群，应按现行大肠菌群计数标准选择MPN法、平板计数法或测试片法。若目标是大肠埃希氏菌计数，应按大肠埃希氏菌计数标准选择适用方法，不能简单用大肠菌群平板结果代替。

十、常见问题与控制建议

十一、培养基质量控制要点

大肠菌群和大肠埃希氏菌计数对培养基质量非常敏感。紫红胆盐乳糖琼脂应具有良好的选择性和乳糖发酵鉴别能力，胆盐沉淀反应应清晰，凝胶强度和pH应稳定。干燥复水膜应关注有效期、储存条件、复水均匀性和显色反应。滤膜法所用培养基应能支持目标菌生长，同时抑制非目标菌干扰。

培养基批次变化、pH偏差、胆盐或结晶紫浓度异常，都可能导致假阳性或假阴性。用于正式检验前，应采用质控菌株验证促生长能力、抑制能力和典型反应。

小结

大肠菌群和大肠埃希氏菌计数是食品和水质卫生评价中的重要内容。紫红胆盐乳糖琼脂平板计数法可用于大肠菌群计数，典型菌落常呈深红色并伴有胆盐沉淀；干燥复水膜法通过预制培养体系和显色底物，使大肠菌群和大肠埃希氏菌计数更加简便；滤膜法则适用于饮用水等低污染、低浊度样品。

需要强调的是，大肠菌群不等于大肠埃希氏菌。选择性平板或复水膜上的典型菌落只能作为计数和筛选依据，正式结果应按现行有效标准进行确认和报告。对于培养基生产和使用实验室而言，VRBA/VRBL、复水膜、滤膜和确认培养基的质量控制，是保证计数结果准确可靠的关键。