非选择性培养基用于微生物菌落筛选和鉴定的方法

在牛乳、土壤、水和食品等样品中，微生物通常以混合菌群形式存在。使用非选择性培养基进行平板计数时，培养基尽量支持多种微生物生长，因此平板上可能出现形态、颜色、大小、边缘、透明度和表面状态不同的菌落。若需要进一步了解样品中可培养微生物的组成，就需要从平板上挑取具有代表性的菌落，进行纯化培养、染色、生化试验、质谱鉴定或分子鉴定。

需要注意的是，非选择性培养基得到的结果只代表“在该培养基、该温度、该时间和该氧气条件下能够生长并形成菌落的微生物”。它不能完整代表样品中全部微生物群落，也不能反映不能在该条件下生长的菌群。因此，用非选择性培养基进行菌落筛选和鉴定时，重点是建立规范的挑菌方法，尽量减少人为偏倚，而不是随意挑取看起来“特别”的菌落。

一、为什么不能随意挑菌

在混合菌平板上，如果实验人员只挑取大菌落、颜色明显的菌落或自己感兴趣的菌落，结果会明显偏向生长快、特征明显的菌群，而忽略数量少、生长慢或形态不突出的菌群。这样得到的菌种组成不能代表平板上实际菌落分布。

例如，某类菌只占平板可培养菌落的约1%，那么平均挑取100个菌落才可能遇到约1个该类菌。若只挑选10个或20个菌落，很容易完全漏掉它。反过来，如果实验人员因为某种菌落颜色特殊而优先挑取，也会高估该类菌在样品中的比例。因此，菌落筛选应采用全数挑取、扇区抽样、随机编号抽样或复制平板等方法，使挑取结果尽量具有代表性。

二、方法一：挑取平板上的全部菌落

当平板上菌落数量较少时，可以挑取平板上的每一个菌落进行纯化和鉴定。该方法最直接，能够最大程度减少挑选偏倚，适合菌落数较少、研究目的要求较高或需要尽量覆盖所有可培养类型的样品。

操作时应先记录平板编号、稀释度、培养基、培养温度和培养时间，再逐一标记菌落位置。挑取时应避免重复挑取同一菌落，也不能挑取已经融合的菌落。每个菌落应转接至适合的纯化培养基上，必要时再次划线纯化。对于外观相似但位置不同的菌落，也应根据实验目的决定是否全部挑取，不能仅凭肉眼判断其一定为同一菌种。

这种方法的缺点是工作量大。当平板上有数十个甚至上百个菌落时，全部挑取会消耗大量培养基、试管、平板和鉴定资源。因此，在菌落数较多时，可采用扇区抽样或随机抽样。

三、方法二：扇区抽样挑取菌落

扇区抽样是从平板中选定一个或多个区域，并挑取这些区域内的全部菌落。常见做法是在平皿底部用记号笔划分为若干扇形区，例如四等分或八等分；也可使用带有扇区和编号的辅助模板，将培养皿同心放置在模板上，再按指定区域挑取菌落。

扇区抽样的关键是“区域选择要预先确定”，不能在看到菌落分布后再选择菌落较多或菌落较特殊的区域。为了减少空间分布不均带来的误差，可选择相对的两个扇区，或按模板顺序逐步增加抽样区域。若第一区域菌落数量不足，可继续选择第二区域、第三区域，直到达到计划挑取数量。一旦开始统计某一区域，就应挑取该区域内全部符合条件的菌落，而不是只挑取其中一部分。

旧文中提到的哈里逊板，本质上就是一种用于平板菌落代表性抽样的辅助模板。它通过固定区域和编号顺序，帮助实验人员从有限数量的菌落中获得相对代表性的样本。现代实验室也可使用透明模板、拍照编号、图像分析软件或随机数表实现类似目的。

四、方法三：复制平板用于生理特性筛选

复制平板法适用于已经在平板表面形成分散菌落、并希望同时检测每个菌落多种生理特性的情况。其基本思路是用无菌复制工具接触原始平板表面的菌落，再按相同位置转印到多个不同培养基上。通过比较不同平板上同一位置菌落的生长、颜色变化、透明圈或抑制情况，可以判断菌落的多项特征。

传统复制工具可使用灭菌棉绒垫或绒布垫固定在圆柱形压印器上，现代实验室也可使用商品化复制接种器、无菌膜或多点接种器。操作时应轻轻接触原始平板，避免压坏琼脂或造成菌落拖拽；转印时应保持方向一致，并在每个复制平板上做好定位标记。通常最后还应转印到对照培养基上，以确认菌体转移是否成功。

复制平板法的优势是能够在保持原始菌落相对位置的同时，比较多个培养条件下的反应。例如可将同一批菌落分别复制到含不同碳源、不同盐浓度、不同pH、不同抗生素或不同指示系统的培养基上，用于初步筛选代谢特征或耐受性差异。其局限是操作要求较高，容易发生转印不完全、交叉污染或位置偏移，因此需要严格无菌操作和清晰编号。

五、菌落筛选后的纯化与鉴定

无论采用哪种挑选方法，挑取的菌落都不能直接视为纯菌株。一个肉眼可见的单菌落通常来源于一个细胞或一个细胞团，但若平板菌落密集、菌落边缘融合或样品中存在贴附生长，就可能出现混合菌落。因此，挑取后应再次划线纯化，必要时重复纯化，直到菌落形态一致、显微镜观察一致，后续鉴定结果稳定。

纯化后可根据实验目的进行革兰染色、镜检、生化反应、酶试验、糖发酵试验、质谱鉴定或分子鉴定。若需要估算不同微生物在原始样品中的分布比例，应将挑取方法、平板稀释度、总菌落数、抽样菌落数和鉴定结果同时记录。只有在抽样具有代表性的前提下，才可对可培养菌群比例作近似估算。

六、常见问题与控制建议

如果挑取结果中某些菌型明显过多，可能是挑菌时偏向了大菌落或特殊菌落，也可能是样品中该类菌确实占优势。应回看平板照片或原始记录，确认抽样是否按预定规则执行。

如果纯化后出现多种菌落形态，说明初始菌落可能不够孤立，或挑取时带入了相邻菌落。应重新从分散良好的平板上挑取单个菌落，并避免从菌落密集区取样。

如果复制平板结果不一致，可能是复制工具压力不均、绒布过湿或过干、菌落转移不足、平板表面水分过多或方向标记错误。复制平板前应保证原始平板菌落清晰、表面不过湿，复制工具应灭菌合格并保持适度干燥。

如果用非选择性培养基估算样品菌群比例，应明确其局限性。不同微生物生长速度不同，菌落大小不同，有些菌在非选择性培养基上可能被快生菌覆盖，有些菌则因培养温度、氧气条件或营养条件不适合而不形成菌落。因此，最终结果应表述为“该培养条件下可培养菌群的构成”，而不是样品全部微生物组成。

七、总结

非选择性培养基可用于混合样品中可培养微生物的计数、菌落筛选和后续鉴定。为了获得具有代表性的结果，不能随意挑取菌落，而应根据平板菌落数量和实验目的选择全数挑取、扇区抽样、随机抽样、形态分层抽样或复制平板等方法。

在实际操作中，挑菌方法、抽样比例、纯化过程和鉴定结果都应完整记录。非选择性培养基的优势是支持面较广，便于观察混合菌群中的多种菌落；局限是不能覆盖所有微生物，也容易受到培养条件和菌群竞争影响。只有规范抽样并结合纯化鉴定，才能更准确地分析样品中可培养微生物的组成。