副溶血性弧菌检验程序：GB 4789.7—2013 方法要点解析

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性弧菌，常与海产品、水产品及相关食品污染有关。它对氯化钠有一定需求，因此在检验过程中，样品制备、增菌、分离和生化鉴定都需要考虑盐浓度条件。GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》规定了食品中副溶血性弧菌的检验方法，检验流程主要包括样品制备、选择性增菌、分离培养、可疑菌落纯化、筛选试验、生化鉴定和结果报告。

副溶血性弧菌检验不能只依靠某一个平板上的菌落颜色。TCBS琼脂或弧菌显色培养基上的可疑菌落，只是筛选依据；最终还需要结合氧化酶试验、革兰氏染色、3%氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性试验、生化试验或生化鉴定系统进行确认。对需要进一步了解菌株特征的样品，还可进行血清学分型和神奈川试验，但这些属于选做项目，不是常规结果报告的唯一依据。

一、副溶血性弧菌检验的总体流程

GB 4789.7—2013 的检验程序可概括为两条路线：一是定性检验，即判断25 g或25 mL样品中是否检出副溶血性弧菌；二是定量检验，即通过多管MPN法估算样品中副溶血性弧菌的最可能数。无论采用定性还是定量路线，核心逻辑都是先用含盐碱性增菌液提高目标菌检出机会，再用选择性平板分离可疑菌落，最后通过筛选和生化鉴定确认。

二、样品制备：水产品样品要注意取样部位

副溶血性弧菌常见于海产品和水产品相关样品，因此样品制备环节很关键。非冷冻样品采集后应低温保存，并尽可能及早检验；冷冻样品应按规定条件解冻，避免过长时间解冻造成菌量变化或样品状态改变。

不同样品取样部位不同。鱼类和头足类动物可取表面组织、肠或鳃；贝类应取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类可取整个动物，或取动物中心部分，包括肠和鳃。带壳贝类或甲壳类样品，应先洗刷外壳并甩干表面水分，再以无菌操作打开外壳取样。这一步的目的不是“清洗掉所有微生物”，而是减少外壳表面杂质对检测的干扰，同时保证目标部位取样具有代表性。

常规定性检验中，取25 g或25 mL样品，加入225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水，制成1:10样品匀液。均质方式可采用旋转刀片式均质器或拍击式均质器；没有均质器时，可用无菌乳钵研磨后再转入无菌锥形瓶。样品匀液要充分均一，否则会影响增菌、分离和最终结果判断。

三、增菌培养：为什么使用3%氯化钠碱性蛋白胨水

副溶血性弧菌具有嗜盐特征，3%氯化钠碱性蛋白胨水是其检验中重要的选择性增菌培养基。蛋白胨提供氮源和营养，3%氯化钠满足弧菌对盐分的需求，偏碱性环境有利于弧菌恢复和增殖，并可在一定程度上抑制部分非目标菌。

增菌培养一般在36℃±1℃进行8～18 h。时间过短可能目标菌尚未充分恢复，时间过长则可能导致非目标菌增加，影响后续分离。增菌结束后，应从增菌液中接种TCBS琼脂或弧菌显色培养基进行分离培养。

四、分离培养：TCBS和弧菌显色培养基的作用

TCBS琼脂是弧菌分离中常用的选择性培养基。培养基中的柠檬酸盐、胆盐等成分提供选择性，蔗糖和指示剂用于显示糖发酵差异。副溶血性弧菌通常不发酵蔗糖，因此在TCBS琼脂上多形成绿色或蓝绿色可疑菌落；而某些发酵蔗糖的弧菌则可形成黄色菌落。但菌落颜色受菌株差异、培养基批次、培养时间和背景菌影响，不能仅凭颜色确认。

弧菌显色培养基可通过特定显色底物增强初筛效率，不同弧菌可能形成不同颜色菌落。但显色培养基的判读规则与厂家配方相关，使用时应按产品说明书和实验室验证结果执行。无论使用TCBS还是显色培养基，挑取可疑菌落后都应接种到3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂进行纯化培养，再进行后续筛选和鉴定。

五、筛选试验：先排除明显非目标菌

纯化后的可疑菌落需进行筛选试验。副溶血性弧菌为革兰氏阴性、无芽胞杆菌，氧化酶阳性，具有运动性。3%氯化钠三糖铁琼脂可用于观察葡萄糖、乳糖、蔗糖发酵及产气、硫化氢等反应。嗜盐性试验则是副溶血性弧菌检验的关键之一：标准中要求分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，在36℃±1℃培养后观察混浊情况；副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠条件下不生长或微弱生长，在6%和8%氯化钠条件下生长旺盛。

筛选试验的价值在于提高后续鉴定效率。如果氧化酶阴性、革兰染色不符、无盐条件下也旺盛生长或高盐条件表现异常，就需要谨慎判定，并考虑是否为其他弧菌、气单胞菌、肠杆菌科细菌或混合菌落。

六、确定鉴定：不能只看一个反应

确定鉴定需要将纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，并进行ONPG等试验。也可选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。使用商品化鉴定系统时，应确认其数据库适用于弧菌，且样品前处理和盐浓度条件符合说明书要求。

副溶血性弧菌的典型生化性状包括：革兰阴性、无芽胞，氧化酶阳性，动力阳性，葡萄糖阳性，蔗糖阴性，甘露醇阳性，赖氨酸脱羧酶阳性，分解葡萄糖不产气，乳糖阴性，硫化氢阴性，V-P阴性，ONPG阴性。实际判定时应综合多个反应，而不能用单一结果替代完整鉴定。

七、定量检验：MPN法的基本思路

GB 4789.7—2013 中的定量检验采用多管MPN思路。通常选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3管3%氯化钠碱性蛋白胨水，培养后从各管接种TCBS琼脂或弧菌显色培养基，挑取可疑菌落并进行确认。根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告每g或每mL样品中副溶血性弧菌的MPN值。

MPN法的优点是适合目标菌数量较低、样品基质复杂或无法直接平板计数的情况；缺点是周期较长，结果为统计估计值，且依赖阳性管确认质量。若可疑菌落未进行完整确认，MPN结果就容易被高估。

八、血清学分型和神奈川试验

血清学分型和神奈川试验在GB 4789.7—2013中属于选做项目。血清学分型通过K抗原、O抗原等抗血清凝集反应辅助了解菌株血清型。神奈川试验是在我妻氏血琼脂上检测特定溶血素相关现象，阳性结果与部分副溶血性弧菌分离株的致病性相关。

需要强调的是，选做项目不能替代基础分离鉴定。常规食品检验报告应首先基于标准规定的分离、生化确认和MPN计算结果。若用于食源性事件调查、风险溯源或菌株特征分析，可根据实验室能力和监管要求增加血清学、毒力基因或分子检测项目。

九、常见问题与质量控制

副溶血性弧菌检验中常见问题包括：增菌后TCBS平板背景菌过多、可疑菌落不典型、氧化酶试验结果不稳定、嗜盐性试验表现异常、生化鉴定结果不一致等。出现这些问题时，应同时检查培养基质量、盐浓度、pH、培养温度、培养时间、质控菌株和挑菌纯度。

3%氯化钠碱性蛋白胨水pH偏低，会降低选择性增菌效果；TCBS琼脂过度加热或保存不当，可能导致选择性下降或颜色异常；3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂盐浓度不正确，会影响纯化菌株生长；氧化酶试剂失效会造成假阴性；可疑菌落未纯化就做生化鉴定，则可能出现混合反应。

实验室应设置阳性质控菌株和阴性质控菌株，验证培养基促生长、选择性、典型菌落和生化反应。对商品化显色培养基或鉴定试剂盒，还应按说明书和内部SOP进行批次验收和性能确认。

十、结果报告

定性检验结果应报告25 g或25 mL样品中检出或未检出副溶血性弧菌。定量检验结果应根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数查MPN表，报告每g或每mL样品中副溶血性弧菌的MPN值。报告时应区分“可疑菌落”“筛选阳性”和“确证阳性”，不能把TCBS上的绿色菌落或显色培养基上的可疑颜色直接写成检出副溶血性弧菌。

十一、总结

副溶血性弧菌检验的核心是“含盐增菌、选择性分离、纯化筛选、综合鉴定”。3%氯化钠碱性蛋白胨水用于提高目标菌检出机会，TCBS琼脂或弧菌显色培养基用于分离可疑菌落，3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂用于纯化，氧化酶、革兰染色、三糖铁、嗜盐性和生化试验共同完成确认。

对培养基生产企业和食品微生物实验室而言，副溶血性弧菌检验的难点不在于单一步骤，而在于盐浓度、培养基选择性、可疑菌落判读和后续确认的连续控制。只有严格执行标准程序，并配合质控菌株和规范记录，才能保证检验结果准确、可靠、可追溯。