副溶血性弧菌的定性与定量检测：GB 4789.7—2013 方法要点解析

副溶血性弧菌是一种嗜盐性革兰阴性弧菌，常与海产品、水产品及相关食品污染有关。GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》将检验流程分为定性检测和定量检测两类。定性检测用于判断规定检样量中是否检出副溶血性弧菌；定量检测则通过多管增菌和最可能数法，也就是MPN法，估算样品中副溶血性弧菌的数量。

两类方法的前处理和鉴定逻辑基本一致：先使用3%氯化钠碱性蛋白胨水进行增菌，再接种TCBS琼脂或弧菌显色培养基进行分离，挑取可疑菌落后进行纯化、氧化酶试验、革兰染色、3%氯化钠三糖铁琼脂试验、嗜盐性试验和进一步生化鉴定。需要注意的是，平板上的绿色菌落或显色培养基上的典型颜色只能提示“可疑”，不能直接作为确证结果。

一、定性检测：判断是否检出目标菌

定性检测通常用于判断25 g或25 mL样品中是否检出副溶血性弧菌。将前一步制备好的1:10样品匀液置36℃±1℃培养8 h～18 h，使样品中的副溶血性弧菌在含盐、偏碱性条件下恢复并增殖。这个环节使用的是3%氯化钠碱性蛋白胨水，既能提供副溶血性弧菌生长所需的盐浓度，又能利用偏碱环境提高弧菌增菌效果。

增菌时间不宜随意缩短或延长。培养不足时，受损菌或低水平污染样品中的目标菌可能未充分恢复；培养过久则可能导致背景菌增加，影响后续分离平板上的菌落判读。因此，36℃±1℃、8 h～18 h不是可有可无的条件，而是定性检测中影响检出率和选择性的关键参数。

二、定量检测：采用MPN法估算菌数

副溶血性弧菌的定量检测不是直接把样品涂布到平板上计数，而是采用多管MPN法。操作时，先取1:10样品匀液1 mL，加入含9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管中，混匀后制成1:100样品匀液。再按同样方法依次制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，应更换一支新的1 mL无菌吸管，防止高浓度样品带入低浓度稀释管，造成稀释误差。

根据样品污染水平估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1 mL，置36℃±1℃培养8 h～18 h。培养后，对显示生长的增菌液进行分离培养。后续经确认阳性的试管数量用于查MPN表，最终换算并报告样品中副溶血性弧菌的MPN值。

MPN法的优势是适合目标菌含量较低、样品基质复杂或背景菌较多的食品样品。其局限是操作周期较长，结果属于统计估计值，而且高度依赖后续确认质量。如果只根据增菌液浑浊或TCBS可疑菌落计算MPN，会导致结果偏高。

三、分离培养：从增菌液中筛选可疑菌落

对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下约1 cm处沾取一环增菌液，划线接种于TCBS平板或弧菌显色培养基平板。每支增菌管应对应一块分离平板，避免混淆来源。平板于36℃±1℃培养18 h～24 h后观察菌落特征。

在TCBS琼脂上，典型副溶血性弧菌菌落多呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，直径约2 mm～3 mm，用接种环轻触时可有类似口香糖的黏性质感。这里的绿色菌落通常与其不发酵蔗糖有关；但TCBS上出现绿色菌落并不等于一定是副溶血性弧菌，因为其他不发酵蔗糖的弧菌或非目标菌也可能形成类似菌落。

从培养箱取出TCBS平板后，应尽快挑取菌落或标记需要挑取的菌落，通常不应超过1 h。原因是TCBS平板上的颜色、透明度和菌落状态可能随放置时间发生变化，延迟挑取会影响典型菌落判断。若使用弧菌显色培养基，应按对应产品说明书判读典型菌落，因为不同厂家显色底物和颜色规则可能不同。

四、纯培养：确保后续鉴定来自单一菌落

从分离平板上挑取3个或以上可疑菌落，划线接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18 h～24 h。挑取多个可疑菌落是必要的，因为同一样品中可能存在多种弧菌或类似菌落，不同可疑菌落的后续鉴定结果可能不同。

纯培养的目的，是获得形态一致、来源清楚的单菌落。若直接从TCBS或显色平板上做生化试验，可能因混合菌落、选择性培养基残留影响或菌体状态不佳而造成异常结果。纯化后的单个菌落再用于氧化酶、染色、三糖铁、嗜盐性和其他生化试验，结果才更可靠。

五、筛选试验：氧化酶、镜检、三糖铁与嗜盐性

纯培养后，首先进行氧化酶试验。副溶血性弧菌通常为氧化酶阳性。氧化酶试剂应新鲜有效，操作时避免使用含铁接种针或污染滤纸，否则可能出现假阳性或假阴性。

涂片镜检时，对可疑菌落进行革兰氏染色。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，无芽胞，可呈杆状、弧状、卵圆状等多形态，具有鞭毛。显微镜形态有辅助意义，但不能单独确认菌种。

随后挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24 h后观察。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的典型反应为：底层变黄、不变黑、无气泡，斜面颜色不变或红色加深，并表现有动力。底层变黄说明葡萄糖发酵产酸；不变黑提示不产硫化氢；无气泡说明通常不产气。

嗜盐性试验是副溶血性弧菌鉴别中的关键步骤。取纯培养单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃±1℃培养24 h后观察液体混浊情况。副溶血性弧菌通常在无氯化钠和10%氯化钠胰胨水中不生长或微弱生长，而在6%和8%氯化钠胰胨水中生长旺盛。这一特征体现了其嗜盐性及对高盐的耐受范围。

六、确定鉴定：综合多个生化反应

确定鉴定应取纯培养物，分别接种含3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36℃±1℃培养24 h～48 h后观察结果。还可使用3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。实验室也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，但必须确认系统适用于副溶血性弧菌，且盐浓度、菌悬液制备和培养条件符合说明书要求。

副溶血性弧菌的典型生化特征包括：氧化酶阳性、葡萄糖阳性、甘露醇阳性、赖氨酸脱羧酶阳性、V-P阴性、ONPG阴性，通常不产气、不产硫化氢。实际判定时，应综合筛选试验和确定鉴定结果，而不能以单一生化反应作为最终结论。

七、定性与定量结果如何报告

定性检测最终应报告“25 g或25 mL样品中检出副溶血性弧菌”或“25 g或25 mL样品中未检出副溶血性弧菌”。只有经过分离、纯化、筛选试验和确定鉴定后，才可作出检出结论。若只在TCBS上观察到可疑绿色菌落，但未完成确认，不能报告为检出。

定量检测应根据每个稀释度中经确认阳性的试管数，组成三位阳性管数，查MPN检索表并按稀释倍数换算，报告每g或每mL样品中的副溶血性弧菌MPN值。这里的“阳性管”不是单纯指增菌液浑浊，也不是指分离平板上出现可疑菌落，而是指该管经后续鉴定确认检出副溶血性弧菌。

八、常见问题与质量控制

如果TCBS平板背景菌过多，可能是增菌时间过长、样品污染水平高、TCBS选择性下降或接种量过大。应检查培养基批次、保存条件、增菌时间和质控菌株表现。

如果可疑菌落很少或目标菌不生长，可能是样品中目标菌受损、3%氯化钠碱性蛋白胨水pH或盐浓度不正确、增菌时间不足、培养温度偏差或平板质量问题。此时应首先检查阳性质控菌株是否能在相同条件下正常生长。

如果氧化酶试验阴性但其他特征接近，应检查试剂是否新鲜、操作材料是否合适、菌龄是否过老。氧化酶试验应使用纯培养的新鲜菌落，避免从选择性平板直接取菌造成干扰。

如果嗜盐性试验结果异常，应重点核对胰胨水中氯化钠浓度。副溶血性弧菌鉴定高度依赖盐浓度表现，0%、6%、8%、10%氯化钠体系配制错误会直接导致误判。

如果生化鉴定系统结果不稳定，可能是菌株未纯化、菌悬液浓度不合适、盐浓度不匹配或数据库覆盖不足。对弧菌类微生物，使用商品化鉴定系统时尤其要关注说明书适用范围。

九、总结

副溶血性弧菌的定性检测和定量检测都以3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌为基础。定性检测用于判断规定检样量中是否检出目标菌；定量检测采用三管MPN法，通过连续稀释、多管增菌、分离确认和查表计算估算菌数。二者都必须经过分离、纯化、筛选试验和确定鉴定，不能只凭TCBS绿色菌落或显色培养基颜色直接下结论。

对实验室而言，控制盐浓度、培养温度、培养时间、可疑菌落挑取时机和后续鉴定质量，是保证副溶血性弧菌检验结果可靠的关键。对培养基生产和质量控制而言，3%氯化钠碱性蛋白胨水、TCBS琼脂、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂、3%氯化钠三糖铁琼脂和嗜盐性试验培养基的性能稳定性，直接决定整个检测流程的准确性。