霉菌和酵母计数：培养方式、抗生素添加与蔓延菌落处理要点

在食品、药品、化妆品和环境样品微生物检测中，霉菌和酵母计数是一项常规项目，但它并不“简单”。与细菌菌落总数相比，霉菌和酵母生长速度差异大，菌落形态变化明显，部分霉菌容易形成气生菌丝和孢子，后期还可能出现蔓延、覆盖、融合和交叉污染。很多计数偏差并不是培养基本身的问题，而是来自培养方式、抗生素添加、观察时机和计数规则理解不准确。

尤其在执行GB 4789.15、药典微生物计数或企业内控方法时，实验室常见争议集中在三个方面：平板到底正置还是倒置培养；培养基是否必须加抗生素、加哪种抗生素、何时添加；霉菌蔓延后如何计数和报告。本文围绕这些关键点进行梳理，帮助实验人员更准确地理解霉菌和酵母计数的操作逻辑，减少假阳性、假阴性和计数失真。

一、霉菌和酵母计数为什么比细菌计数更容易出问题

霉菌和酵母都属于真菌，但二者在平板上的生长表现差异很大。酵母多形成圆形、湿润、乳白色或有色菌落，形态上较接近细菌菌落；霉菌则常形成绒毛状、絮状、粉末状或放射状菌落，随着培养时间延长，菌丝可能迅速扩展，孢子也可能脱落并形成次生污染。因此，霉菌和酵母计数不是单纯“培养到规定天数后数一数”，而是要在标准规定的培养条件下，尽量保持菌落形态清晰、位置稳定和结果可追溯。

从方法学角度看，霉菌和酵母计数的核心目标是统计样品中能够在规定培养条件下形成可见菌落的真菌数量。结果通常以CFU/g或CFU/mL表示。需要注意的是，CFU并不等同于单个细胞数量，尤其对于霉菌而言，一个菌落可能来自一个孢子，也可能来自一个菌丝片段或孢子团。因此，样品均质、稀释、混匀、培养基选择和菌落判读都会影响最终结果。

二、正置培养与倒置培养：不能脱离标准谈“对错”

平板培养有两种放置方式：正置培养是皿盖在上、培养基在下；倒置培养是培养基在上、皿盖在下。对于细菌计数，倒置培养更常见，因为可以减少冷凝水滴落到培养基表面。霉菌和酵母计数则更复杂：倒置培养有利于减少冷凝水冲刷菌落，但霉菌成熟后产生的孢子在翻动、观察或移动过程中可能脱落；正置培养减少翻转动作，却可能增加冷凝水滴落和气流扰动带来的风险。

因此，正置或倒置不能简单用“好”或“坏”评价，必须以现行有效标准和企业验证方法为准。对于食品检测，现行GB 4789.15-2016采用的培养方式应按标准执行；若后续修改单正式发布并调整为倒置培养，实验室应及时修订SOP、原始记录模板、培训资料和方法确认文件。在征求意见稿阶段，可以提前评估变化对实验室操作的影响，但正式出具法定检测报告时，仍应遵循当前有效版本。

实际操作中，最重要的是减少不必要的移动和开盖。霉菌平板在培养后期非常容易产生孢子，频繁取放、翻转、摇晃或打开皿盖，都可能造成孢子散落到同一平板其他位置，甚至污染培养箱内其他平板。观察时应优先隔着皿底或皿盖观察，必要时用记号笔在皿底标记早期菌落位置，而不是反复开盖确认。

三、培养基选择：PDA、孟加拉红琼脂与SDA各有定位

霉菌和酵母计数常用培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、孟加拉红琼脂或孟加拉红氯霉素琼脂、沙氏葡萄糖琼脂（SDA）等。不同标准体系对培养基有不同规定，不能随意替换。例如，食品检测应按GB 4789.15规定培养基执行；药品微生物计数通常以药典方法为准；化妆品、环境样品或企业内控方法也应依据相应标准或经验证的方法。

PDA营养丰富，适合多种霉菌和酵母生长，但对部分生长快的霉菌，菌落蔓延可能较明显。孟加拉红琼脂中的孟加拉红可限制部分霉菌菌落扩展，使菌落更易计数；氯霉素用于抑制细菌干扰。SDA酸性较强、糖浓度较高，也常用于真菌培养，但若样品中细菌负荷较高，单纯SDA可能不能充分抑制细菌，需要按方法要求添加抗生素或采用选择性培养基。

原稿中“孟加拉红琼脂本身不含氯霉素”的说法不能一概而论。不同标准、不同厂家、不同产品名称可能存在差异。有些产品为“孟加拉红琼脂”，有些明确为“孟加拉红氯霉素琼脂”或“虎红氯霉素琼脂”；自配培养基也可能要求灭菌后另行加入氯霉素。因此，实验室不能只看培养基中文简称，应核对标准处方、产品标签、说明书和批次质控报告，确认是否含有抗生素及其浓度。

四、抗生素添加：不是越多越好，也不能随意替换

霉菌和酵母计数中添加抗生素的目的，是抑制样品中的细菌生长，避免细菌大量覆盖平板、干扰真菌菌落观察和计数。常用抗生素包括氯霉素、庆大霉素、金霉素或氯四环素等，不同标准体系和培养基配方选择不同。食品检测中较常见的是氯霉素，常见终浓度为100 mg/L；部分国际或企业方法也会使用氯霉素与其他抗生素组合。

抗生素添加必须遵守三个原则：第一，法定检测必须按标准规定使用，不能随意更换抗生素种类；第二，自配培养基时应按处方要求在适宜温度下加入，通常不宜在高温灭菌前或培养基过热时加入热敏性抗生素；第三，若为企业内控方法或替代方法，应进行方法适用性或等效性验证，确认目标霉菌和酵母能正常恢复生长，同时细菌干扰得到有效控制。

抗生素不是越多越安全。过高浓度、错误种类或加入方式不当，都可能影响霉菌和酵母恢复，导致计数偏低。对于药品、化妆品等含防腐剂或抑菌成分样品，还要警惕“样品本身抑菌+培养基抗生素”的叠加效应。若方法适用性试验显示目标菌回收率不合格，应调整稀释、中和或培养基方案，而不是简单提高抗生素浓度。

自配含氯霉素培养基时，常见做法是将氯霉素用适宜溶剂配制成一定浓度储备液，过滤除菌后，在灭菌培养基冷却至约45～50℃时加入并充分混匀，再倾注平板。操作时应注意储备液浓度、加入体积、最终浓度、溶剂影响、过滤除菌完整性和避光保存条件，并在培养基批记录中完整记录。

五、正置、倒置与抗生素的关系：解决的是不同问题

培养方式主要影响冷凝水、平板污染和孢子扩散；抗生素主要解决细菌干扰；孟加拉红或其他选择性成分主要帮助限制部分霉菌蔓延。三者不能互相替代。倒置培养不能替代抗生素，因为细菌仍可能在培养基表面或内部生长；添加抗生素也不能解决冷凝水滴落造成的菌落冲散；孟加拉红能减缓部分霉菌蔓延，但对所有霉菌都不是绝对有效。

实验室在排查霉菌和酵母计数异常时，应先判断问题类型。如果平板上出现大量细菌样小菌落，通常应检查抗生素是否添加、培养基是否过期、抑菌成分是否失效；如果菌落呈水流状扩散，应检查冷凝水、平板表面水分和培养方式；如果同一批多个平板出现相似霉菌污染，应考虑样品本身污染、操作污染或培养箱交叉污染；如果空白对照有菌落，则该批检测结果应按无效或异常处理。

六、计数范围与结果报告：按标准，不按经验凑数

霉菌和酵母计数通常选择菌落数在规定范围内的平板进行计算。GB 4789.15-2016中常用计数范围为10～150 CFU/皿。这个范围低于细菌菌落总数常见的30～300 CFU/皿，原因是霉菌菌落较大、形态复杂、容易蔓延或融合，菌落数过多时更容易漏计和误判。

原稿中提出“霉菌最佳计数范围10～50个”的说法可作为实验经验提示，但不能替代标准规则。正式检测报告必须按现行有效标准规定选择平板、计算和报告。若企业内控希望设置更严格的“最佳观察范围”，可以作为SOP中的质量提示或复核条件，但不能与法定标准冲突。

特别要注意：“低于计数范围”和“未检出”不是一回事。例如某个最低稀释度平板有少量菌落，即使低于标准推荐计数范围，也不能随意报告为未检出；应按标准规则计算并注明相应情况。只有所有适用稀释度和原液平板均无菌落时，才可按方法检出限报告为小于某一数值。

七、蔓延菌落如何处理：不建议随意按面积比例推算

霉菌蔓延是霉菌和酵母计数中最麻烦的问题之一。蔓延菌落可能来自毛霉、根霉、部分青霉、曲霉或样品中其他快速生长真菌，也可能由于平板表面过湿、冷凝水滴落、培养基表面水分过多或培养过程中移动过频造成。蔓延后，菌丝可能覆盖其他较小菌落，使早期菌落无法识别，导致计数偏低或偏高。

原稿中“轻度蔓延按无蔓延区域比例推算全皿数量”的建议不宜作为正式检测通用规则。对于霉菌和酵母计数，按面积比例推算通常缺乏可靠依据，因为霉菌在平板上的分布并不一定均匀，蔓延区域可能覆盖多个原始菌落，也可能只是一个菌落扩展形成。除非采用的标准或经验证SOP明确允许，否则不建议在正式报告中用面积比例估算全皿菌落数。

更稳妥的处理方式是：若蔓延较轻且未影响其他菌落识别，可计数可清晰辨认的菌落，并在记录中注明蔓延情况；若蔓延覆盖范围较大、影响其他菌落判断，或无法区分原始菌落与次生菌落，应记录为“菌落蔓延”或“不可准确计数”，并按标准要求选择其他稀释度平板、重新检测或启动异常调查。对于高污染样品，可提前选择更高稀释度，降低蔓延平板对结果的影响。

八、第3天观察与第5天计数：不能机械相加

霉菌和酵母培养过程中，早期观察非常重要。部分霉菌在第3天左右即可形成可见菌落，若继续培养到第5天，菌落可能显著扩大、产生孢子甚至覆盖周围菌落。早期观察可以帮助识别原始菌落位置，减少后期蔓延造成的漏计。若未来标准修改单正式引入第3天观察和第5天终观察要求，实验室应按新标准更新记录表，将初次观察结果、终观察结果、蔓延情况和报告规则固定下来。

但“第3天计数加第5天新长出的菌落”不能作为通用规则。原因是第5天出现的新小菌落，可能是真正的迟发菌落，也可能是第3天霉菌孢子脱落形成的次生菌落；若简单相加，可能造成重复计数或过度计数。更合理的做法是第3天先不开盖观察并标记早期菌落位置，第5天再进行终观察，结合菌落位置、形态和蔓延情况按标准规则判定。若标准要求取高值、记录蔓延或选择特定时间点结果，应按标准执行。

观察过程中不应随意打开皿盖。霉菌孢子极易随气流扩散，开盖观察会增加实验室环境污染和交叉污染风险，也可能造成其他平板假阳性。必要的挑菌、镜检或鉴定应在生物安全要求和SOP规定下进行，并采取局部消毒、器具灭菌和废弃物灭菌处理。

九、降低霉菌计数偏差的实操控制点

要提高霉菌和酵母计数的准确性，关键不是某一个技巧，而是全流程控制。样品处理时要充分均质，防止霉菌菌丝团或酵母细胞团分布不均；稀释时要选择足够梯度，避免全部平板过密或全部低于范围；倒板时培养基温度应适宜，防止热损伤或提前凝固；平板凝固后表面不应有明显水膜；培养箱温度和湿度要稳定，避免冷凝水大量形成；培养期间减少移动和翻动，尤其是霉菌生长后期。

培养基质量控制同样重要。每批培养基应检查外观、pH、凝固状态、无菌性、促生长能力和选择性。含抗生素培养基还要关注抗生素有效性和添加记录。商品化成品培养基应核对批号、有效期、储存条件和质检报告；自配培养基应记录灭菌条件、添加剂批号、加入温度、配制日期和使用期限。若霉菌酵母计数长期偏低或细菌背景长期偏高，首先应回查培养基质量和抗生素添加情况。

十、常见问题与纠正建议

总结

霉菌和酵母计数的难点，不在于能否让真菌长出来，而在于能否让菌落在规定时间内保持可识别、可计数、可追溯。正置与倒置培养应服从现行有效标准和实验室SOP；抗生素添加应按培养基处方和方法要求执行，不可随意增减或替换；蔓延菌落不能简单按面积比例推算，必须按标准规则记录、选择合适平板或重新检测；第3天观察可帮助识别早期菌落，但不能机械地与第5天新增菌落相加。

对实验室而言，稳定的霉菌和酵母计数结果来自四个方面：合适的培养基、正确的抗生素添加、受控的培养方式和严格的计数规则。对培养基生产和使用单位而言，PDA、孟加拉红琼脂、SDA及其含抗生素版本，都应明确配方依据、适用标准、质控菌株、促生长能力、选择性和储存条件。只有把标准要求和微生物生长特性结合起来，霉菌和酵母计数才能真正做到准确、可靠、可复核。