GB 4789.3-2025标准更新后大肠菌群检测常见问题与实操解答

GB 4789.3-2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》已发布实施，代替GB 4789.3-2016。新版标准对术语定义、设备和材料、培养基和试剂、检验程序、操作步骤、结果报告及附录内容进行了调整，并将大肠菌群计数测试片纳入标准方法体系。对食品微生物实验室而言，这次更新不是简单替换标准号，而是涉及SOP修订、方法确认、培养基验收、测试片使用、前处理扩项、结果判定和原始记录管理的一整套体系更新。

大肠菌群并不等同于大肠埃希氏菌。标准中的大肠菌群，是指在一定培养条件下能够发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。因此，在GB 4789.3体系下，判断逻辑以“方法规定条件下的乳糖发酵产酸产气表型”为核心，而不是以是否鉴定为大肠埃希氏菌为唯一依据。这一点直接影响LST、BGLB、VRBA平板确认和测试片结果判定。

一、新版标准更新后，实验室首先要做什么

GB 4789.3-2025实施后，实验室应先完成标准差异识别，而不是直接把旧版SOP标题改成新版标准号。建议从“人、机、料、法、环、测”六个维度逐项确认：人员是否完成新版培训，设备是否满足新版温度和规格要求，培养基、试剂、测试片是否符合新版要求，方法流程是否与新版一致，环境和无菌操作是否受控，原始记录和报告格式是否能覆盖新版结果判定规则。

对于已经具备GB 4789.3检测能力的实验室，通常需要开展方法确认或方法验证。这里不建议一概称为“方法学验证”，因为GB方法属于标准方法，实验室重点是证明本单位在现有人员、设备、培养基、测试片、样品基质和记录体系下能够正确执行该标准。若只是标准文本修订但核心检测流程无实质变化，可开展差异确认和能力确认；若新增测试片法、变更培养基供应商、变更关键设备、扩展新样品基质或改变前处理方式，则应开展更充分的方法确认或验证。

判断是否属于“技术变更”的核心标准，是看该变化是否可能直接影响检验结果。凡是可能影响目标菌复苏、生长、产气、菌落显色、阳性确认、计数计算和结果报告的变化，都应按技术变更管理，而不能只作为普通文件更新处理。

二、MPN法、平板计数法和测试片法如何选择

GB 4789.3-2025仍保留两类核心检测思路：MPN计数法和平板计数法。第一法MPN法适用于大肠菌群含量较低的食品，第二法平板计数法适用于大肠菌群含量较高的食品。测试片法被纳入标准后，为实验室提供了更便捷的计数工具，但并不意味着所有样品都可以无条件替代原方法。

方法选择应依据产品标准、样品污染水平、检测目的、委托要求和实验室已确认能力。若产品标准明确规定采用某一方法，应按产品标准执行；若标准允许选择，则应根据样品预期污染水平选择合适方法。低污染样品采用MPN法更容易获得统计学意义上的估算结果；高污染样品采用平板计数法或测试片法更便于直接计数。若使用测试片，应严格按照测试片产品说明书进行加样、培养、判读和必要的确认操作，不能把VRBA平板法的确认步骤机械套到所有测试片产品上。

测试片的加入，是新版标准的重要变化，但不是“免质控”“免确认”的理由。测试片属于完全可即用培养基或即用型检测材料，应符合GB 4789.28相关质量要求。实验室应建立批次验收制度，至少关注无菌性、促生长能力、选择性、指示特性、包装完整性、有效期、储存条件和说明书适用范围。

三、大肠菌群测试片如何验收与使用

新版标准提出大肠菌群计数测试片应以发酵乳糖产酸产气为阳性结果判断依据，且性能符合GB 4789.28中相关培养基质量要求。实际执行时，很多实验室会问：测试片到底参照GB 4789.28附录F中的哪一种培养基验收？这里要把逻辑理清。

测试片不是传统意义上某一种单一琼脂平板，它的组成、指示系统、产气显示方式和判读规则由产品设计决定。因此，实验室不能简单只按VRBA平板菌落形态照搬验收，也不能只看供应商报告就不做任何验收。较合理的做法是：参考GB 4789.28中与大肠菌群检测功能最接近的培养基质量要求，结合生产企业提供的说明书和质控资料，建立适合本实验室使用的验收方案。无法直接套用附录中的菌落形态要求时，可按测试片说明书规定的阳性特征进行判读。

若使用测试片后是否需要BGLB确认，应按测试片说明书和标准规定执行。若产品说明书已明确其判读规则和确认要求，实验室应按说明书执行；若说明书要求挑取典型菌落进一步确认，则应执行确认；若说明书明确无需后续BGLB确认，则不应额外把VRBA平板法确认步骤强行叠加，除非实验室SOP或客户要求另有规定。

测试片挑取典型菌落时，应在培养完成后按说明书打开上层膜或指定结构，用无菌接种环从凝胶层或菌落所在位置挑取目标菌落。挑取时要避免刮取过多凝胶、相邻菌落或气泡区域，必要时可选择菌落清晰、周围反应典型的位置进行确认。

四、LST和BGLB产气如何判定

大肠菌群MPN法的关键是产气判断。新版标准对LST初发酵和BGLB复发酵均强调产气观察：小倒管或产气收集装置内有气泡产生，或轻轻振摇后可见细密气泡不断上升，即可判断为产气。这里的难点在于“小气泡”如何处理。

如果培养前小倒管内没有气泡，培养后出现气泡，或轻轻振摇后有连续细密气泡上升，应按产气处理。若只是小倒管顶部存在一个极小气泡，且不能确认是否为培养前残留空气，应结合培养前记录、管内混浊情况、平行管表现、培养时间和操作过程综合判断。不能把所有小气泡都机械判阳，也不能因为气泡少就直接判阴。

API或其他生化鉴定显示“不是大肠埃希氏菌”，并不必然推翻大肠菌群阳性结果。大肠菌群包含多个属和种，只要在GB 4789.3规定条件下符合乳糖发酵产酸产气等判定逻辑，就应按标准方法报告。若额外鉴定结果与标准表型矛盾，例如鉴定为理论上不应发酵乳糖产气的菌种，则应优先排查挑菌污染、混合菌、鉴定数据库误判、培养管交叉污染或读数错误，而不是随意改写标准结果。

五、VRBA平板法的关键点：典型菌落不是最终结果

VRBA平板法中，典型大肠菌群菌落通常表现为红色至紫红色，周围可有红色沉淀环；可疑菌落也需要按标准要求挑取确认。VRBA的作用是通过结晶紫、胆盐、中性红和乳糖体系对大肠菌群进行选择和初筛，但它不能直接证明产气。因此，VRBA上的典型或可疑菌落仍需通过BGLB确认，按确认阳性率计算最终结果。

很多实验室容易犯两个错误：第一，只数VRBA典型菌落，不做BGLB确认，直接报告大肠菌群；第二，只挑典型菌落，不挑可疑菌落，导致结果偏低。新版标准明确要求从同一稀释度VRBA平板上挑取典型和可疑菌落进行确认，少于规定数量时挑取全部。最终结果要根据典型菌落数、可疑菌落数及各自确认阳性率计算，而不是只按肉眼“像不像”判断。

平板法中，标准要求根据估计污染状况选取2个～3个适宜连续稀释度，每个稀释度接种2个平板，并设置空白对照。若实验室只做一个稀释度，原始记录当然应如实记录，但这不能自动证明检测符合标准。除非产品标准、方法确认或特殊情况有明确依据，否则只做一个稀释度存在无可计数平板、无法按附录规则计算、结果代表性不足的风险。

六、GB 4789.38-2025的5管法不能套用到GB 4789.3-2025

有实验室会问：GB 4789.38-2025大肠埃希氏菌MPN计数法对贝类及产品规定每个稀释度接种5管，那么GB 4789.3-2025大肠菌群MPN法是否也要改成5管？答案是不能套用。

GB 4789.38检测对象是大肠埃希氏菌，GB 4789.3检测对象是大肠菌群；不同标准的适用范围、样品类型、统计表和确认逻辑并不相同。执行GB 4789.3时，应按GB 4789.3规定的管数、稀释度和MPN检索表执行。不能因为另一个标准对某类产品采用5管法，就擅自修改GB 4789.3的MPN体系。否则，结果计算和标准符合性都会出现问题。

七、旧产品标准、MPN/100 g与新版GB 4789.3如何衔接

部分食品产品标准，特别是历史较早的产品标准，可能仍使用“MPN/100 g”或“MPN/100 mL”等指标单位，并引用旧版大肠菌群检测方法。例如鲜冻禽产品相关标准和历史公告中曾涉及GB/T 4789.3-2003与GB/T 4789.3-2008之间的衔接问题。实验室不能简单认为GB 4789.3-2025发布后，所有历史指标都可以自动转换为MPN/g、CFU/g或使用新版任一方法。

正确做法是：先看现行产品标准、食品安全国家标准公告、监管部门要求和委托检测要求；再判断指标单位、限量表达和检测方法是否匹配。若产品标准明确引用特定版本方法或指标单位与旧公告有关，应按法规衔接文件执行，必要时在报告中清晰说明检测依据。若客户要求使用GB 4789.3-2025，应确认其产品标准允许该方法，并确认结果单位与限量单位可以合理对应。

八、样品前处理扩项怎么做

样品前处理是大肠菌群检测中最容易低估的环节。GB 4789.3中的基础前处理为固体和半固体样品称取25 g，加225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水，制成1∶10样品匀液；液体样品通常取25 mL加225 mL稀释液制成1∶10样品匀液。必要时可调节pH至6.5～7.5。对于软糖、胶体、油脂、高糖、高盐、粉末、冷冻肉、复合调味品等特殊基质，单纯“按25 g+225 mL”不一定能保证均质效果。

前处理扩项不是只看稀释液、均质袋和吸头合格即可，也不是每次都必须把所有阳性菌全部做一遍。较合理的做法是选择代表性基质，结合目标菌株或阳性样品，验证样品处理方式不会明显损伤目标菌，不会产生抑菌干扰，能够形成均匀可移取的样品匀液，并能按标准流程检出目标反应。若样品本身含抑菌成分，应增加稀释、中和或方法适用性确认。

对于QQ软糖这类样品，不建议整包直接丢入热水中溶解。高温可能损伤微生物，整包处理也不利于无菌称样和代表性控制。更稳妥的方式是无菌剪碎或切小块，加入规定比例稀释液后充分均质；若确需升温促进软化，应控制在温和范围内，并通过方法确认说明该处理不影响目标菌检出。

九、称样量50 g+450 mL是否算偏离

在微生物检测中，25 g+225 mL是常见的1∶10样品匀液制备方式。若实验室采用50 g+450 mL，比例仍为1∶10，理论上不改变稀释倍数，但是否属于偏离要看标准、SOP、资质认定范围和样品处理能力。

如果标准或实验室SOP明确允许采用其他取样量并保持相同比例，且均质设备、容器容量、样品代表性和方法确认均能支持，则50 g+450 mL可作为等比例前处理方式使用，并在原始记录中如实记录。若SOP固定写明25 g+225 mL，检测人员现场擅自改为50 g+450 mL，则属于未按SOP操作，至少应作为偏离记录和技术评估处理。

因此，建议实验室不要只在口头上说“比例一样就行”，而应在SOP中明确允许范围，例如“可根据样品代表性和检测需要，在保持1∶10比例的前提下调整取样量，但应保证均质效果并记录实际取样量和稀释液体积”。

十、调pH用NaOH和HCl是否需要无菌

GB 4789.3允许必要时用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节样品匀液或液体样品原液pH至6.5～7.5。由于这些试剂直接加入微生物检测样品中，原则上应保证无菌或以无菌方式制备、分装和使用。否则，调pH过程本身可能引入外源菌，影响大肠菌群检测结果。

NaOH和HCl通常不需要高压蒸汽灭菌。它们可以使用无菌水和无菌容器配制，或采用适宜方式除菌、采购无菌成品试剂，并在无菌条件下分装和使用。高浓度酸碱液高压灭菌存在容器、腐蚀和安全风险，也不属于常规必要操作。关键不是“是否必须121℃灭菌”，而是“加入样品前必须避免带入微生物污染，并有配制、有效期和使用记录”。

十一、非脱羧勒克菌、API鉴定与大肠菌群结果如何处理

检测大肠菌群时，有时会从LST和BGLB阳性管中分离出其他肠杆菌科菌种，例如勒克菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、柠檬酸杆菌属等。实验室容易误以为“不是大肠埃希氏菌就不能算大肠菌群”，这是错误的。大肠菌群是一个基于一定培养条件下乳糖发酵产酸产气的检测群体，不是单一菌种。

如果标准流程中LST产气、BGLB确认产气，则按GB 4789.3的判定逻辑，应作为大肠菌群阳性管参与MPN结果计算。若额外生化鉴定显示为某种不典型菌，需结合该菌是否具备乳糖发酵产气能力判断。若鉴定结论与产气表型不一致，应调查是否存在混合菌、挑菌不纯、API数据库识别误差、接种错误或污染，而不是简单用API结果否定标准方法结果。

十二、原始记录应如何覆盖新版标准要求

新版标准实施后，原始记录模板必须同步更新。记录不只是为了“能填”，而是要能支撑结果复核。MPN法记录应包括样品制备时间、接种完成时间、稀释度、每稀释度管数、LST 24 h和48 h产气结果、BGLB 24 h和48 h产气结果、阳性管组合、MPN表查表结果和最终单位。平板法记录应包括稀释度、平行皿编号、空白对照、VRBA典型和可疑菌落数、挑取确认数量、BGLB确认阳性数量、阳性率、计算过程和修约方式。测试片法记录应包括测试片批号、加样量、培养条件、阳性判读依据、是否按说明书确认、计数照片或图示记录。

如果平板法实际只做了一个稀释度，原始记录应如实记录，但实验室还必须评估是否偏离标准。记录真实不等于结果合规。对于标准要求2个～3个连续稀释度的项目，建议按标准布置稀释度，避免因结果过高或过低而无法按标准计算。

十三、实验室落地新版标准的建议清单

GB 4789.3-2025落地建议按以下顺序执行。第一，完成新版标准与旧版标准差异分析，形成变更评估表。第二，修订SOP、原始记录、报告模板、培训材料和异常处理流程。第三，确认LST、BGLB、VRBA、稀释液、NaOH、HCl、测试片等材料均符合新版要求。第四，对新增或变更方法开展方法确认，特别是测试片法和特殊样品前处理。第五，按GB 4789.28建立培养基和测试片批次验收制度。第六，开展人员培训和盲样或加标样考核，确认人员能够正确判断产气、典型菌落、可疑菌落和测试片阳性反应。第七，将新版标准纳入内审和质量监督计划，重点检查记录完整性和结果计算正确性。

总结

GB 4789.3-2025的实施，使大肠菌群检测从传统MPN法和平板计数法进一步扩展到测试片法，同时对培养基、试剂、设备、结果判定和报告记录提出了更细化的要求。实验室不能只关注“标准号更新”，更要关注检测逻辑是否真正更新：MPN法以LST初发酵和BGLB复发酵产气为核心；平板法以VRBA初筛、BGLB确认和阳性率计算为核心；测试片法以产品说明书和乳糖发酵产酸产气判读为核心；培养基和测试片质量则应纳入GB 4789.28质量控制体系。

对食品企业和第三方实验室而言，新版标准落地的关键不是背诵问答，而是建立可执行、可追溯、可复核的检测体系。凡是可能影响检验结果的人、机、料、法、环变化，都应纳入技术变更评估；凡是特殊样品、测试片、新培养基或新设备，都应通过方法确认或质量验收支撑。只有这样，GB 4789.3-2025下的大肠菌群检测结果才具有真正的标准符合性和质量可信度。