空肠弯曲菌增菌与分离培养：从样品处理到鉴定确认

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是重要的食源性病原菌，常与禽肉、未充分加热的肉制品、未经巴氏杀菌的乳制品、污染水源及交叉污染食品有关。该菌为革兰氏阴性、弯曲或螺旋状小杆菌，具有微需氧特性，对氧、干燥、低pH、冷冻和长时间贮存等环境应激较敏感。也正因为如此，空肠弯曲菌的检验不能只依靠普通肠道菌分离思路，而需要合适的复苏、选择性增菌、微需氧培养和选择性平板分离条件。

需要说明的是，国内现行食品安全国家标准已从单独“空肠弯曲菌检验”扩展为空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验。因此，在食品检测和培养基配套开发中，不宜只关注空肠弯曲菌，也应关注结肠弯曲菌的恢复、生长和鉴定表现。

一、为什么弯曲菌检验需要增菌

弯曲菌在食品样品中的数量往往较低，并且容易受到冷藏、冷冻、氧暴露、干燥、酸性环境和加工过程损伤。受损弯曲菌直接接种到强选择性平板上，可能因抗生素、胆盐、去氧胆酸盐或氧化压力而无法恢复，导致假阴性。因此，样品处理和增菌步骤对提高检出率非常关键。

弯曲菌增菌的核心目的有三个：一是让受损菌体恢复活力；二是在微需氧环境下促进目标菌增殖；三是通过选择剂抑制样品中的伴随菌，降低后续平板分离时的背景干扰。

二、增菌方法的差异：不能简单说“都有前增菌”

不同标准体系对弯曲菌增菌的设计思路并不完全一致。FDA、ISO、USDA及我国GB方法在样品种类、前处理方式、是否设置预增菌、选择性增菌液、抗生素组合、培养温度和培养时间上存在差异。旧资料中“FDA、USDA、ISO都有前增菌，而GB和SN没有”的表述过于简单，容易造成误解。更准确的说法是：不同方法会根据样品类型、损伤程度和背景菌水平，设置不同形式的复苏、预增菌或选择性增菌步骤。

以FDA BAM方法为例，其强调弯曲菌对应激非常敏感，预增菌、微需氧环境以及血液、血红素、炭末等氧清除或保护成分可提高受损菌恢复率。ISO方法则采用检测或直接平板分离的水平方法框架，并在修订中加入了分子确认、Preston肉汤补充剂和培养基性能测试相关调整。我国GB 4789.9—2025则已将检验对象扩展为空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。

因此，不能脱离标准版本和样品类型直接比较“哪个方法更好”。对于受损菌较多、背景菌复杂的样品，适当复苏和合理选择性增菌非常重要；对于目标菌负荷较高、背景菌相对可控的样品，直接分离或较短流程也可能满足检测目的。

三、增菌液与选择剂的作用

弯曲菌增菌液通常需要同时满足“保护目标菌”和“抑制杂菌”两个目标。常见增菌体系包括Bolton肉汤、Preston肉汤、弯曲菌增菌液等。培养基中常含蛋白胨、酵母浸粉、乳酸蛋白胨或其他营养成分，并可加入血液、血红素、丙酮酸盐、炭末等成分，以降低氧化应激或改善受损菌恢复。

选择剂方面，头孢哌酮、万古霉素、甲氧苄啶、两性霉素B或环己酰亚胺等常用于抑制革兰阳性菌、部分革兰阴性背景菌和真菌。不同方法和培养基的选择剂组合不同，不应随意替换。若抗生素效价不足，背景菌会突破；若选择剂过强，则可能抑制受损弯曲菌。

弯曲菌选择剂的使用需要特别谨慎。头孢哌酮是弯曲菌培养基中常见选择剂，但样品背景中存在耐头孢菌或ESBL菌株时，可能出现背景菌过度生长，影响分离。此时应通过培养基优化、平板组合、稀释接种或过滤法提高分离效率。

四、分离培养：平板组合影响检出率

增菌后需要将增菌液接种到选择性分离平板上。常用平板包括mCCDA琼脂、Skirrow血琼脂、Preston琼脂、Campy-Cefex类培养基、哥伦比亚血琼脂加选择剂或弯曲菌显色培养基等。不同平板的选择性和菌落表现不同，因此许多方法建议使用两种平板或互补平板，以提高检出率并减少漏检。

原资料中提到FDA和USDA在增菌液接种平板时有稀释步骤，SN采用0.65 μm滤膜过滤除杂菌，GB和ISO方法直接接种平板。这个说法反映了不同方法的部分差异，但不能作为固定结论。实际操作中是否稀释、是否过滤、是否同时接种两种平板，应根据现行标准文本、样品背景和实验室验证结果执行。

0.65 μm滤膜法的逻辑是利用弯曲菌体积小、运动性强的特点，使其穿过滤膜到达培养基表面，而较大的杂菌或运动性弱的背景菌被阻留。该方法对背景菌复杂的样品有帮助，但不能简单替代选择性平板，也不能忽略目标菌数量低或活力差时的漏检风险。

五、典型菌落表现

弯曲菌在选择性平板上的菌落通常较小，湿润、灰白至淡灰色，有时带金属光泽，部分菌株呈扩散生长倾向。不同培养基上的表现会有差异。例如mCCDA上可疑菌落常呈淡灰色、湿润、扁平、有金属光泽，并有沿接种线扩散趋势；血琼脂类平板上可出现灰色、湿润、有光泽、扁平或分散凸起的菌落。

弯曲菌菌落判读难度较高。背景菌、培养时间、微需氧条件、平板含水量和选择剂强度都会影响菌落形态。对于可疑菌落，应挑取多个典型和可疑菌落进行纯化与鉴定，不能只凭菌落外观作最终结论。

六、鉴定：先初筛，再确认

弯曲菌鉴定通常包括初步鉴定和最终确认。初步鉴定主要用于快速判断可疑菌落是否属于弯曲菌属，减少后续工作量；最终确认则用于确定是否为空肠弯曲菌、结肠弯曲菌或其他相关弯曲菌。

初步鉴定通常包括菌体形态、运动性、革兰染色、氧化酶试验、触酶试验、微需氧生长和温度生长特性等。弯曲菌通常为细小弯曲杆菌，革兰阴性，具有特征性运动，氧化酶阳性。空肠弯曲菌常表现为马尿酸水解阳性，而结肠弯曲菌通常马尿酸水解阴性，但单一生化项目不能替代完整鉴定。

现代标准方法中，质谱鉴定和实时荧光PCR的应用越来越多，可提高确认效率和准确性。但培养分离仍然重要，因为只有获得活菌株，才能进一步进行药敏、分型、污染溯源和菌株保存。

七、影响检出率的关键因素

弯曲菌检出率受多个因素影响，最关键的是样品状态、微需氧条件、选择性强度和分离平板组合。样品暴露于空气时间过长、冷冻损伤严重、pH偏低、背景菌过多或培养基保存不当，都会降低检出率。

弯曲菌培养基的质量控制应包括目标菌生长能力、典型菌落特征和非目标菌抑制性。常用质控菌株可包括空肠弯曲菌、结肠弯曲菌及常见背景菌，如大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等。对于新批次选择剂、血液、炭末、添加剂或基础干粉，应通过性能测试确认后再用于正式检验。

八、不同方法比较的实际意义

FDA、USDA、ISO、GB、SN等方法差异的本质，是针对不同样品类型、监管目标和实验室条件建立的检测策略。FDA方法更强调受损菌恢复和复杂食品样品处理；USDA方法更聚焦禽类样品和产业监管；ISO方法强调食品链通用性；GB方法则服务于我国食品安全国家标准体系。

对培养基生产和检测实验室而言，比较这些方法的意义不在于简单判断谁优谁劣，而在于理解以下几点：第一，弯曲菌恢复对样品处理和增菌条件高度敏感；第二，单一平板可能漏检部分菌株，互补平板可提高检出率；第三，过强选择性会降低受损菌恢复率，过弱选择性会导致背景菌干扰；第四，最终确认不能只依赖菌落形态，必须结合生化、质谱或分子方法。

结语

空肠弯曲菌的增菌与分离培养是一套对细节高度敏感的检测流程。样品处理决定目标菌能否被有效释放，复苏和增菌决定受损菌能否恢复，选择性平板决定可疑菌落能否被分离，鉴定确认决定结果是否可靠。由于弯曲菌微需氧、对氧和环境应激敏感，培养基中血液、血红素、炭末、丙酮酸盐等保护成分，以及头孢哌酮、万古霉素、两性霉素B等选择剂的合理使用，都直接影响检出率。实际检验中，应严格按照现行标准方法执行，并结合样品背景、培养基质量控制和实验室验证结果优化操作流程。