β型溶血性链球菌检测培养基与试剂配制要点：以GB 4789.11—2014为例

β型溶血性链球菌是食品微生物检验中的重要检测对象之一。其典型特征是在血琼脂平板上形成完全透明的溶血环，即β溶血。GB 4789.11—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验》中涉及的培养基和试剂主要包括改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（mTSB）、哥伦比亚CNA血琼脂、革兰氏染色液、TSB、草酸钾血浆、氯化钙溶液和3%过氧化氢溶液等。这些培养基和试剂分别服务于增菌、选择性分离、溶血观察、形态鉴别和生化确认环节。

需要注意，β型溶血性链球菌的检验不能只看“血平板上有透明圈”。部分葡萄球菌、李斯特菌、芽胞杆菌或其他溶血菌也可能产生溶血现象，因此必须结合菌落形态、革兰染色、触酶试验、生化反应和标准规定的确认步骤综合判断。

一、检测流程中的培养基分工

GB 4789.11—2014所列培养基并不是孤立使用，而是构成一个完整检测流程。mTSB用于样品增菌，哥伦比亚CNA血琼脂用于选择性分离和观察β溶血，TSB用于纯培养或后续试验，革兰染色液和过氧化氢溶液用于初步鉴别，血浆和氯化钙溶液则用于相关确认试验。

二、改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（mTSB）

mTSB是在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）基础上加入多黏菌素和萘啶酸制成的选择性增菌培养基。TSB提供丰富营养，多黏菌素和萘啶酸用于抑制部分革兰阴性菌及背景杂菌，从而提高β型溶血性链球菌的检出机会。

1. TSB基础培养基配方

制备时，将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃高压灭菌15 min，冷却备用。葡萄糖存在时应避免过度灭菌，否则可能造成颜色加深、pH下降或营养成分变化。

2. 抗生素溶液

原文称“萘啶酮酸钠溶液”，更规范的理解是：萘啶酸本身水溶性较差，经少量氢氧化钠助溶后形成可溶性盐形式，再经滤膜除菌使用。抗生素类成分不应随基础培养基高压灭菌，应在基础培养基灭菌冷却后无菌加入。

3. 完全培养基

无菌条件下将抗生素溶液加入灭菌冷却后的TSB中，充分混匀后分装备用。按上述比例计算，多黏菌素和萘啶酸在培养基中的终浓度约为10 mg/L。配制后应按标准或产品说明规定条件保存，避免长时间放置导致抗生素效价下降。

三、哥伦比亚CNA血琼脂：选择性分离和β溶血观察的核心平板

哥伦比亚CNA血琼脂是检测β型溶血性链球菌的重要选择性血平板。“CNA”通常指Colistin/Nalidixic Acid，即多黏菌素类抗生素和萘啶酸组合。该组合可抑制多数革兰阴性菌，使革兰阳性球菌更容易分离出来；加入5%脱纤维绵羊血后，可观察链球菌的β溶血表现。

1. 基础培养基配方

将基础培养基成分溶于蒸馏水中，加热使其完全溶解，121℃高压灭菌15 min。原资料中A.2与A.3编号存在明显混乱，实际可理解为“哥伦比亚CNA基础培养基”和“加入无菌脱纤维绵羊血后的完全培养基”两个部分。

2. 加血制备要点

当基础培养基冷却至约45℃时，在无菌条件下加入无菌脱纤维绵羊血，轻轻混匀后倾注平板，每皿约15 mL。加入血液时温度控制非常关键：温度过高会导致红细胞裂解，使平板颜色加深，接近巧克力琼脂状态，影响β溶血环观察；温度过低则琼脂易凝固，造成血液分布不均。

制成的血平板应呈均匀红色，表面平整，无气泡、无污染、无明显溶血背景。使用前需适当干燥，避免表面水分过多导致菌落扩散、溶血环模糊或交叉污染。预制平板如未干燥，室温放置不宜过久；冷藏保存时应防止脱水和冷凝水过多。

四、脱纤维绵羊血：质量直接影响溶血判读

β溶血观察高度依赖血液质量。标准方法中可通过玻璃珠振摇去除血纤维制备脱纤维绵羊血，但实际生产和检验中更推荐使用质量受控的商品化无菌脱纤维绵羊血。血液应无菌、无明显自溶、无凝块、颜色正常，并能支持标准质控菌株形成典型溶血。

β型溶血表现为菌落周围红细胞完全溶解，形成透明溶血环。α溶血为绿色或草绿色改变，γ溶血为无溶血。检测β型溶血性链球菌时，应重点挑取具有典型透明溶血环的可疑菌落进行后续确认。

五、革兰氏染色液：确认革兰阳性链状球菌

β型溶血性链球菌为革兰氏阳性球菌，常呈链状排列。革兰染色是从血平板可疑菌落进入鉴定流程的基础步骤，可帮助排除革兰阴性菌、杆菌或明显不符合链球菌形态的杂菌。

操作时，涂片火焰固定后，结晶紫染色约1 min，水洗；碘液作用约1 min，水洗；95%乙醇脱色约15～30 s，脱色至流出液基本无紫色，立即水洗；沙黄复染约1 min，水洗、干燥后镜检。脱色过度会导致革兰阳性菌假阴性，脱色不足会导致革兰阴性菌假阳性。链球菌老龄培养物也可能出现染色不均，因此建议使用新鲜纯培养物。

六、TSB：纯培养和后续试验基础培养基

TSB是通用营养型肉汤，可用于β型溶血性链球菌纯培养、菌悬液制备或后续确认试验。其配方与mTSB基础培养基相同，但不加入多黏菌素和萘啶酸。

制备时加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃灭菌15 min，分装备用。TSB不具备选择性，不能替代CNA血琼脂进行分离，也不能用于直接判断β溶血。

七、草酸钾血浆和氯化钙溶液：配套确认试剂

原资料列出草酸钾血浆和氯化钙溶液。草酸钾可通过结合钙离子防止血液凝固，离心后取上清即为草酸钾血浆。后续试验中加入氯化钙，可补充钙离子，使血浆凝固或溶解相关反应得以发生。此类试剂应按标准方法使用，不宜脱离检测流程单独解释为普通培养基。

原文中“A.7 0.25%氯化钙溶液”与“无水氯化钙22.2 g/L”不一致。按质量体积百分比计算，22.2 g/L为2.22%（w/v），不是0.25%。若严格执行标准，应以正式标准文本和实验室SOP为准；若用于产品说明或知识库文章，应标注该处存在数值与名称不一致的问题，避免误配。

使用人血制备血浆涉及生物安全和伦理来源问题，实验室实际操作中应使用来源合规、经质量控制的商品化血浆或按机构批准程序制备，不宜随意采集人员血液制备。

八、3%过氧化氢溶液：触酶试验关键试剂

3%过氧化氢用于触酶试验。链球菌通常触酶阴性，葡萄球菌通常触酶阳性，因此触酶试验是区分链球菌和葡萄球菌的重要初筛步骤。试验时可挑取新鲜菌落，与3%过氧化氢接触，若迅速产生大量气泡，提示触酶阳性；无明显气泡为触酶阴性。

需要注意，不能从血琼脂上直接大量带入血液成分进行触酶试验，因为红细胞也含有过氧化氢酶样活性，可能造成假阳性。应尽量挑取菌落本体，避免刮取培养基和血液背景。

九、培养基性能质控要点

β型溶血性链球菌检测培养基的质控应覆盖三个方面：目标菌生长能力、β溶血典型性和非目标菌抑制性。mTSB应支持目标菌增菌，同时对部分背景菌具有抑制作用；CNA血琼脂应支持β型溶血性链球菌形成典型透明溶血环，并抑制多数革兰阴性菌。

常用质控思路包括使用β溶血性链球菌作为阳性对照，使用非目标革兰阴性菌验证CNA选择性，并使用触酶阳性菌和触酶阴性菌验证过氧化氢试剂。具体菌株、接种量和判定标准应按GB 4789.28—2024、GB 4789.11—2014、产品说明书和实验室SOP执行。

十、常见问题与处理

结语

GB 4789.11—2014中β型溶血性链球菌检测涉及的培养基和试剂，核心是mTSB增菌和哥伦比亚CNA血琼脂分离。mTSB通过TSB营养基础与多黏菌素、萘啶酸组合实现选择性增菌；CNA血琼脂通过营养丰富的哥伦比亚基础、选择性抗生素和5%脱纤维绵羊血，实现目标菌分离和β溶血观察。革兰染色、触酶试验、血浆相关试剂和后续确认试验共同构成完整判定体系。实际配制和使用时，应重点控制抗生素过滤除菌、血液质量、加血温度、平板干燥、pH、无菌性和质控菌株反应，不能仅凭血平板透明圈作最终判断。