蜡样芽胞杆菌检验培养基与试剂：GB 4789.14—2014配方原理与使用要点

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是食品微生物检验中常见的条件致病菌，可污染米饭、淀粉类制品、乳制品、调味品、肉制品、豆制品、即食食品以及加工环境。该菌能形成芽胞，对干燥、热处理和环境压力有较强耐受性，部分菌株可产生呕吐毒素或腹泻相关毒素，引起食源性疾病。GB 4789.14—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》规定了食品中蜡样芽胞杆菌的计数和确认方法，涉及MYP琼脂、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、营养琼脂、动力培养基、硝酸盐肉汤、酪蛋白琼脂、糖发酵管、V-P培养基、TSSB血琼脂、溶菌酶营养肉汤、西蒙氏柠檬酸盐培养基、明胶培养基等多种培养基和试剂。

这些培养基并不是简单罗列，而是分别承担样品稀释、选择性分离、计数、纯化、生化确认和与相近芽胞杆菌区别的作用。对于培养基生产和实验室应用而言，理解各成分作用和配制要点，比机械照抄配方更重要。

一、检测思路：先选择性分离，再综合确认

蜡样芽胞杆菌检验的核心思路是：通过适宜稀释液处理样品，在选择性鉴别平板上分离可疑菌落，再通过形态、生化和必要的确认试验判断。MYP琼脂是最常用的选择性鉴别培养基之一，典型蜡样芽胞杆菌在MYP上通常表现为不发酵甘露醇、产生卵磷脂酶，形成粉红色至紫红色菌落，并有卵黄反应形成的沉淀环。

但需要注意，MYP上的“粉红色菌落+卵黄沉淀环”只是可疑表现，并不能直接等同于蜡样芽胞杆菌。蜡样芽胞杆菌群成员之间相近，部分非目标芽胞杆菌也可能出现类似反应，因此必须结合后续确认试验。

二、PBS磷酸盐缓冲液：用于样品稀释和菌体保护

PBS磷酸盐缓冲液用于样品稀释和菌悬液制备。其主要作用是提供相对稳定的pH环境，减少样品稀释过程中因渗透压或pH变化造成的菌体损伤。

制备时，先配制贮存液：称取34.0 g磷酸二氢钾溶于约500 mL蒸馏水，用1 mol/L氢氧化钠调节pH至7.2，再定容至1000 mL，冷藏保存。使用时取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装后121℃高压灭菌15 min。调pH时不应机械加入固定体积氢氧化钠，应以pH计实测结果为准。

三、MYP琼脂：蜡样芽胞杆菌分离计数的关键培养基

MYP琼脂全称为甘露醇卵黄多黏菌素琼脂，是蜡样芽胞杆菌分离计数的经典选择性鉴别培养基。其选择性来自多黏菌素B，鉴别性主要来自甘露醇、酚红和卵黄液。

配制时，先将蛋白胨、牛肉粉、D-甘露醇、氯化钠和琼脂加入950 mL蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.1，加入酚红溶液，分装每瓶95 mL，121℃高压灭菌15 min。临用时加热融化，冷却至约50℃，每瓶加入50%卵黄液5 mL和规定浓度的多黏菌素B溶液1 mL，混匀后倾注平板。

MYP平板的关键在于后加成分。卵黄液和多黏菌素B不宜随基础培养基高压灭菌，否则卵黄成分可能变性，多黏菌素效价也可能受影响。加卵黄时温度过高会导致蛋白凝聚，温度过低则琼脂易凝固并造成平板不均匀。

四、MYP菌落判读：粉红色加卵黄反应只是“可疑”

蜡样芽胞杆菌通常不发酵甘露醇，因此在含酚红的MYP上不产酸，菌落及周围培养基多保持粉红色至紫红色；同时该菌通常产生卵磷脂酶，可分解卵黄成分，在菌落周围形成白色沉淀环或混浊区。这是MYP上最典型的可疑表现。

若菌落呈黄色或周围培养基变黄，说明该菌可能发酵甘露醇，不符合典型蜡样芽胞杆菌表现。若有粉红色菌落但无卵黄沉淀环，也应谨慎判读。MYP平板上可疑菌落必须挑取纯化后做确认试验。

五、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤：用于选择性增菌

胰酪胨大豆多黏菌素肉汤是在TSB基础上加入多黏菌素B形成的选择性增菌液。TSB提供丰富营养，多黏菌素B用于抑制部分革兰阴性菌及杂菌，有助于低水平蜡样芽胞杆菌样品的富集。

基础培养基应先溶解、调pH至7.3±0.2并121℃灭菌15 min。多黏菌素B应临用前无菌加入，不能随基础培养基高压灭菌。若多黏菌素B效价不足，背景菌可能突破；若浓度过高，也可能影响目标菌恢复。

六、营养琼脂：纯化和保存基础培养基

营养琼脂用于可疑菌落纯化和一般培养。它不具备选择性，主要用于获得纯培养物，为后续触酶、动力、生化和染色观察提供材料。

制备时调pH至7.2±0.2，121℃高压灭菌15 min。纯化平板应无污染、无明显脱水、表面平整。由于蜡样芽胞杆菌菌落较大且可扩散，划线纯化时应注意分区充分。

七、触酶试验：蜡样芽胞杆菌通常阳性

蜡样芽胞杆菌通常触酶阳性。试验时用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个新鲜菌落，置于洁净试管或载玻片上，加入3%过氧化氢溶液，30 s内出现气泡为阳性，不产生气泡为阴性。

3%过氧化氢应临用新鲜配制或使用经验证有效的成品试剂。过氧化氢易分解，长期放置、受光照或污染后可能导致假阴性。若从含血培养基上挑菌，应避免带入血液成分，以免产生干扰。

八、动力培养基：区分蜡样芽胞杆菌群成员的重要试验

蜡样芽胞杆菌通常有动力，在半固体动力培养基中可沿穿刺线向周围扩散生长；蕈状芽胞杆菌常呈绒毛状、根状或蜂巢状扩散；炭疽芽胞杆菌通常不运动。因此，动力试验是蜡样芽胞杆菌群鉴别的重要项目之一。

培养基调pH至7.2±0.2，分装每管2～3 mL，115℃高压灭菌20 min。试验时用接种针穿刺接种，30℃±1℃培养48 h±2 h。蜡样芽胞杆菌沿穿刺线扩散生长，提示有动力。若使用悬滴法观察，蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌通常运动活泼，而炭疽芽胞杆菌不运动。

原资料中另列“A.11动力培养基”，配方为蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠和低浓度琼脂，可作为另一类半固体动力培养基理解。两类动力培养基的共同点是琼脂浓度较低，以便观察菌体从穿刺线向周围扩散。

九、硝酸盐肉汤：观察硝酸盐还原能力

蜡样芽胞杆菌通常可还原硝酸盐。硝酸盐肉汤以蛋白胨提供营养，硝酸钾作为底物。接种后36℃±1℃培养24～72 h，加入对氨基苯磺酸试剂和甲萘胺试剂，若立即或数分钟内出现红色，说明硝酸盐已被还原为亚硝酸盐，为阳性。

若加甲液、乙液后不显红色，应加入少量锌粉。若加锌粉后出现红色，说明硝酸盐仍未被细菌还原，为阴性；若加锌粉后仍不变红，说明硝酸盐可能已被还原为亚硝酸盐以外的产物，也按阳性理解。该步骤容易误判，必须设置阳性、阴性对照。

十、酪蛋白琼脂：检测酪蛋白酶活性

酪蛋白琼脂用于检测酪蛋白分解能力。蜡样芽胞杆菌可产生胞外蛋白酶，分解酪蛋白，在菌落周围形成透明区。由于酪蛋白本身不完全溶解，培养基通常呈乳白色混悬状态，阳性反应表现为菌落周围澄清透明区。

点种可疑菌落后，36℃±1℃培养48 h±2 h观察，阳性者菌落周围出现透明区。若阴性，应继续培养至72 h再观察。酪蛋白不会完全溶解是正常现象，不应误认为培养基配制失败。

十一、硫酸锰营养琼脂与碱性复红：用于芽胞相关观察

硫酸锰营养琼脂可促进部分芽胞杆菌形成芽胞，常配合染色方法观察芽胞形成情况。锰离子对芽胞形成具有促进作用，营养成分则支持菌体生长。

0.5%碱性复红可用于相关染色步骤。制备时取碱性复红0.5 g溶于20 mL乙醇，再用蒸馏水稀释至100 mL，过滤后备用。染色试剂应避光保存，使用前观察是否有沉淀、变色或污染。

十二、糖发酵管：观察厌氧条件下葡萄糖发酵

糖发酵管用于观察菌株在厌氧条件下是否发酵葡萄糖或其他糖类。基础配方中含牛肉粉、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠和溴麝香草酚蓝。葡萄糖发酵管加入0.5%葡萄糖，并放置倒置小管观察产气。

原资料中写“培养基由红色变为黄色”，但配方使用的是溴麝香草酚蓝，酸性反应应表现为黄色，未产酸时通常为绿色至蓝绿色或蓝色调。因此，更准确的表述是：若菌株厌氧发酵葡萄糖产酸，指示剂变黄；是否产气则观察倒置小管中是否有气泡。若使用酚红体系，才可出现红色至黄色的变化。

蔗糖等易水解糖类若不耐热，应采用过滤除菌后无菌加入，避免高压灭菌导致糖水解而产生假阳性或背景酸化。

十三、V-P培养基：检测乙酰甲基甲醇生成

V-P试验用于检测菌株是否通过丁二醇发酵途径产生乙酰甲基甲醇。培养基含葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和氯化钠。接种后36℃±1℃培养48～72 h，加入α-萘酚和氢氧化钾，充分振摇，阳性反应出现红色。

V-P试验对氧化反应较敏感，加入试剂后需要充分振摇，以利于显色。若短时间未显色，可继续放置或按标准要求延长观察，但应避免超过规定时间造成误判。

十四、TSSB羊血琼脂：观察溶血等特征

胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB）是在营养丰富的胰酪胨大豆琼脂基础上加入无菌脱纤维羊血制成，用于观察菌落形态和溶血特征。蜡样芽胞杆菌常可表现β溶血，但溶血性不能作为单一确认指标。

基础培养基灭菌后冷却至45～50℃，再加入无菌脱纤维羊血。温度过高会导致血液变性或出现巧克力样变化，影响溶血观察；温度过低会造成血液混匀不均或琼脂提前凝固。

十五、溶菌酶营养肉汤：蜡样芽胞杆菌耐受性试验

溶菌酶营养肉汤用于观察菌株在含低浓度溶菌酶条件下的生长情况。蜡样芽胞杆菌通常能在含0.001%溶菌酶的培养基中生长。若24 h阴性，可继续培养24 h再观察。

溶菌酶是蛋白类物质，对热敏感。原资料提供了酸溶加热和过滤除菌两种方式。实际配制时，更应关注溶菌酶活性是否保留以及溶液无菌性。采用过滤除菌方式更有利于保护酶活，但滤膜孔径原文为0.45 μm；若按更严格除菌要求，实验室应依据标准文本和验证程序选择滤膜并确认无菌性。

十六、西蒙氏柠檬酸盐、明胶培养基等确认试验

西蒙氏柠檬酸盐培养基用于检测菌株能否以柠檬酸盐作为唯一碳源。阳性表现为斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色。明胶培养基用于检测明胶液化能力，接种后培养，再置2～8℃冷却30 min观察是否仍为液体。蜡样芽胞杆菌通常可液化明胶，但具体结果应与其他生化特征综合判断。

这些确认试验均应使用纯培养物，且应设置阳性、阴性对照。若前期纯化不彻底，多个菌种混杂会导致生化结果混乱。

十七、培养基和试剂质控要点

蜡样芽胞杆菌检验培养基的质控应覆盖选择性、鉴别性、促生长能力和生化反应准确性。MYP平板应能支持蜡样芽胞杆菌形成典型粉红色菌落和卵黄沉淀环，同时抑制部分非目标菌；多黏菌素肉汤应兼顾目标菌恢复和背景菌抑制；生化培养基应能给出清晰、可重复的阳性或阴性结果。

常见质控菌株可包括典型蜡样芽胞杆菌作为阳性对照，以及适当非目标菌用于评价选择性和鉴别性。若MYP上目标菌生长差、粉红色不典型、卵黄沉淀不清晰或杂菌大量生长，应从多黏菌素、卵黄液、pH、灭菌条件、平板保存和菌株状态等方面排查。

结语

GB 4789.14—2014中蜡样芽胞杆菌检验涉及的培养基和试剂较多，但其逻辑清晰：PBS用于样品稀释，MYP琼脂用于选择性分离和计数，胰酪胨大豆多黏菌素肉汤用于选择性增菌，营养琼脂用于纯化，动力、硝酸盐、酪蛋白、糖发酵、V-P、溶菌酶、柠檬酸盐和明胶等试验用于综合确认。实际应用中，最容易出现问题的是MYP平板的卵黄反应、多黏菌素效价、糖发酵指示剂判读、动力培养基琼脂浓度和生化试剂有效性。蜡样芽胞杆菌属于蜡样芽胞杆菌群，单一平板特征不能作为最终结论，必须结合形态、生化、动力、酶反应和标准规定流程综合判定。