测量不确定度与取样：微生物实验室结果可靠性的关键环节

在微生物检测中，结果常被写成“菌落总数为多少CFU/g”“大肠菌群未检出”“沙门氏菌阴性”或“单增李斯特菌阳性”。这些结果看似明确，但实际检测过程受到样品分布、取样、运输、均质、稀释、接种、培养、计数、确认和人员判读等多种因素影响。测量不确定度和取样管理，正是用来识别、控制和解释这些影响因素的重要工具。

测量不确定度不是“检测不准确”的代名词，而是对检测结果可能分散范围的合理估计。对于微生物实验室而言，理解不确定度可以帮助实验室判断结果可靠性、比较批次差异、解释临界值结果，并改进检测流程。取样则是结果代表性的起点，如果样品本身不能代表被检对象，后续检测再准确也难以得到有意义的结论。

一、什么是测量不确定度

测量不确定度是指与测量结果相关联的参数，用于表征可合理归属于被测量值的分散性。通俗地说，就是一个检测结果可能波动的合理范围。对于微生物定量检测，例如菌落总数、大肠菌群计数、霉菌酵母计数、乳酸菌计数等，结果通常受样品不均匀性和微生物随机分布影响，因此不确定度评价具有实际意义。

例如同一样品进行菌落总数检测，即使操作人员、培养基和设备都合格，不同平板之间的菌落数也可能不同。这种差异并不一定是错误，而是微生物检测本身具有随机性和分散性。

二、微生物检测中的不确定度来源

微生物检测的不确定度来源较多，既包括实验室内部操作，也包括样品本身的非均匀性。食品、环境样品、饲料、化妆品和药品样品中，微生物往往不是均匀分布，而是呈团块、黏附、局部污染或低水平随机分布。这使得微生物检测比许多理化检测更容易受到取样和分样影响。

实验室应识别这些分量，并证明关键因素处于控制状态。例如移液器已校准、培养箱温度受控、培养基经过性能确认、质控菌株代次受控、人员经过能力确认等。

三、哪些项目需要评定测量不确定度

一般来说，微生物定量检测结果更适合进行数值化不确定度评定。例如平板计数法、MPN法、膜过滤计数法、菌落总数测定、乳酸菌计数、霉菌酵母计数等，都可根据方法和实验室数据估计不确定度。

对于定性检测，如“沙门氏菌25 g中未检出”“单增李斯特菌检出/未检出”，传统测量不确定度概念不能直接套用为一个±值。但这并不意味着定性检测没有不确定性。定性检测更应关注检出限、方法灵敏度、特异性、阳性符合率、阴性符合率、假阳性、假阴性、基质干扰和接种量控制等指标。

四、定性检测中的不确定性：重点是假阳性和假阴性

定性检测结果只有阳性或阴性，但影响因素仍然很多。目标菌数量接近检出限时，平行样可能出现一个阳性、一个阴性；选择性增菌过强可能导致假阴性；背景菌过多可能抑制目标菌或造成假阳性菌落；确认试验挑菌数量不足也可能漏检。

因此，定性方法应通过方法确认、阳性对照、阴性对照、空白对照、基质加标、检出限验证、人员比对和污染控制来降低不确定性。对于有判定限或最低检出水平要求的方法，接种量的不确定度尤其重要。

五、取样为什么会影响检测结果

微生物在样品中的分布通常不均匀。一个批次食品中，某个部位可能污染严重，另一个部位可能没有目标菌；液体样品如果没有充分混匀，上层和下层微生物数量也可能不同；表面样品则受取样面积、擦拭力度、湿润程度和表面材质影响明显。因此，取样往往是微生物检测结果变异的重要来源。

如果实验室不负责取样，只接收客户送检样品，那么实验室通常只能对收到样品的检测结果负责；若实验室负责现场取样，并且报告结果用于代表某一批产品、某一区域或某个环境状态，则取样方案、取样过程和取样不确定性就成为结果解释的重要部分。

六、取样不确定度是否应纳入检测不确定度

原资料中提到“了解待检微生物的分布情况，分样时予以考虑，但建议不把这种不确定度包括在内，除非委托人有这方面要求”。这一表述需要更准确地说明：如果实验室的检测范围仅从“收到样品”开始，通常评估的是实验室检测过程的不确定度，不包括客户取样造成的代表性不确定度；如果实验室负责取样，或报告结果用于推断整批产品或现场状态，则应考虑取样对结果的影响，至少在方案、记录和结果解释中说明。

简单说，是否纳入取样不确定度，取决于实验室责任边界和报告声明范围。不能一概排除，也不能在没有取样数据的情况下随意给出取样不确定度。

七、取样基本要求

取样的目标是获得能代表被检对象的样品，同时避免外来污染和目标菌损失。取样过程应按标准方法、合同要求或经确认的取样方案执行，并做好记录。

取样工具、采样袋、采样瓶、拭子、海绵、稀释液和运输箱都应适合检测目的。对无菌样品或低水平目标菌检测，取样污染可能直接造成假阳性；对易损伤微生物检测，运输条件不当可能造成假阴性。

八、运输和储存条件：保持样品状态不变

样品从采集到实验室检测之间的运输和储存，是结果可靠性的关键阶段。样品温度过高可能导致细菌增殖；温度过低或反复冻融可能导致部分微生物死亡；运输时间过长可能改变菌群结构；容器泄漏或包装破损可能造成污染或样品损失。

实验室接收样品后，应检查并记录样品状态。若发现样品泄漏、腐败、温度不符合要求、标签不清或数量不足，应按程序评估是否接收，并在报告或记录中说明可能影响。

九、样品接收、识别与传递

样品进入实验室后，应建立完整的样品识别和传递程序。每个样品应有唯一编号，确保从接收、储存、前处理、检测、复核到报告的全过程可追溯。

原资料中“没有特殊要求的，实验室一般不保留样品”应谨慎理解。是否留样，应根据检测性质、样品稳定性、客户要求、法规要求、争议风险和实验室程序确定。食品微生物样品往往不适合长期保留，因为微生物数量会随时间变化，但关键样品、争议样品或法规要求样品可能需要按规定保存。

十、样品处置与废弃

检测结束后，样品和相关废弃物应按污染风险处理。高污染样品、增菌液、培养物、接触样品的耗材和剩余样品，不能直接作为普通垃圾丢弃。应采用高压灭菌、化学消毒或其他有效方式灭活后，再按规定处置。

样品处置应有记录，尤其是高风险样品、阳性样品、客户争议样品和法规检测样品。

十一、实验室如何控制不确定度分量

实验室不一定需要把所有因素都量化成复杂公式，但必须识别关键不确定度分量，并证明这些因素处于受控状态。对微生物实验室而言，最实用的方法是通过标准化操作、设备校准、质控菌株、平行样、重复性数据、能力验证和趋势分析来控制不确定性。

如果某个分量对结果影响很大，例如取样不均、样品运输温度失控、稀释误差或培养温度异常，应优先控制，而不是只在报告中给出一个不确定度数值。

十二、结果接近限量值时如何解释

微生物检测结果接近法规限量、客户标准或判定限时，不确定度和取样影响尤其重要。例如某产品菌落总数接近限量值，或定性方法目标菌处于低水平污染状态，重复检测可能出现差异。此时实验室应按方法、合同和判定规则处理，不应简单忽略检测变异。

判定规则应在检测前明确，而不是在结果出来后临时决定。尤其是涉及合格/不合格判断时，应避免因不确定度理解不一致造成争议。

十三、常见误区

结语

测量不确定度和取样管理，是微生物实验室保证结果可靠性的两个关键环节。定量检测结果应识别并评估主要不确定度来源，如样品均匀性、稀释、接种、培养、计数和确认；定性检测虽然通常不直接给出数值不确定度，但必须控制影响假阳性和假阴性的因素。取样则决定了样品是否具有代表性，实验室应根据自身责任范围明确是否考虑取样不确定度。无论实验室是否负责取样，都应记录样品接收状态、运输储存条件、样品识别、处置过程和异常情况。只有把取样、样品管理和检测过程控制结合起来，微生物检测结果才真正具备可解释性和可追溯性。