酶底物法检测生活饮用水：总大肠菌群与大肠埃希氏菌快速判读方法

生活饮用水微生物安全，是评价水质卫生状况的核心内容之一。传统生活饮用水微生物检测常用多管发酵法、滤膜法和平板计数法。近年来，酶底物法因操作相对简便、检测时间较短、可同时判断总大肠菌群和大肠埃希氏菌，被广泛用于生活饮用水和水源水微生物指标检测。

酶底物法的基本思路是：利用总大肠菌群和大肠埃希氏菌具有特定酶活性的特点，在培养基中加入对应酶底物。目标菌生长并分解底物后，产生颜色或荧光变化。检测人员通过观察颜色和荧光，即可判断水样中是否存在总大肠菌群和大肠埃希氏菌；配合定量盘或多孔系统，还可按阳性孔数查表计算MPN值。

一、酶底物法检测什么

酶底物法主要用于检测生活饮用水中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌。总大肠菌群常作为水体受到环境污染或管网污染的卫生指示菌群；大肠埃希氏菌与粪便污染关系更密切，是评价饮用水粪便污染风险的重要指标。

需要注意，少数大肠埃希氏菌菌株β-葡萄糖醛酸苷酶活性可能异常，个别非目标菌也可能产生类似反应。因此，酶底物法虽然通常不需要传统确认试验，但仍必须依赖标准方法、质控菌株、对照和判读规则保证结果可靠。

二、方法原理：显色判断总大肠菌群，荧光判断大肠埃希氏菌

酶底物法培养基通常含有营养成分、选择性抑制成分和特异性酶底物。总大肠菌群能够利用β-半乳糖苷酶分解显色底物，使培养液由无色或浅色变为黄色；大肠埃希氏菌通常具有β-葡萄糖醛酸苷酶，可分解荧光底物，在365 nm紫外光下产生蓝白色荧光。

这种“颜色+荧光”的组合，使酶底物法能够在同一份100 mL水样中同时判断两个指标，较传统多管发酵法更省时。

三、方法优点

与传统方法相比，酶底物法最大的优势是操作流程简化和结果判读较快。多数情况下，可在18 h～24 h获得结果，必要时可延长至规定时间上限。

酶底物法特别适合饮用水中低污染水平样品的快速筛查和常规监测。对于需要大量检测样品的实验室，可显著减少多管发酵法的工作量。

四、方法局限

酶底物法虽然成熟，但并非没有局限。其成本通常高于传统多管发酵法和滤膜法；试剂、定量盘、封口设备和紫外观察设备均需配套；某些特殊水样可能存在抑制物、颜色干扰或荧光干扰。

对含消毒剂残留较高的水样，应按标准要求采样并使用含硫代硫酸钠等中和剂的采样瓶，以避免余氯继续杀灭细菌造成假阴性。

五、基本操作流程

酶底物法常用100 mL水样作为检测体积。将专用干粉培养基加入水样中，充分溶解后转入定量盘或专用反应容器，经压膜封口后培养。培养结束后观察颜色和荧光变化。

若只进行定性判断，可观察整瓶或反应体系是否变黄、是否有荧光；若进行定量检测，应使用符合方法要求的定量盘并按阳性孔数查表。

六、结果判读

培养24 h后，培养液或阳性孔出现黄色，通常判为总大肠菌群阳性；在紫外灯下观察到蓝白色荧光，则判为大肠埃希氏菌阳性。若24 h时颜色可疑，可按说明书或标准延长培养至28 h。超过规定时间后出现的颜色或荧光反应，一般不作为阳性结果。

荧光观察应在暗处进行，使用规定波长紫外灯。判读时应设置阴性对照和阳性对照，避免将培养基本底荧光、瓶体反光或水样自身荧光误判为阳性。

七、定量结果如何报告

使用定量盘时，培养后分别记录大孔和小孔中的阳性孔数，再按相应MPN表查得MPN值。结果通常以MPN/100 mL报告。若所有孔均阴性，报告为未检出或小于方法检出限；若所有孔均阳性，报告为大于该定量盘上限。

对于生活饮用水卫生评价，结果不仅要看是否检出，还要结合现行生活饮用水卫生标准中的限值要求进行判定。

八、与生活饮用水卫生标准的关系

现行GB 5749—2022《生活饮用水卫生标准》中，生活饮用水微生物常规指标包括菌落总数、总大肠菌群和大肠埃希氏菌。总大肠菌群和大肠埃希氏菌在100 mL水样中均不应检出。标准还明确，当水样检出总大肠菌群时，应进一步检验大肠埃希氏菌；当水样未检出总大肠菌群时，不必检验大肠埃希氏菌。

酶底物法可在同一体系中同时获得总大肠菌群和大肠埃希氏菌结果，适合现行指标体系下的快速检测需求。

九、质量控制要点

酶底物法操作简单，但必须严格质量控制。检测结果的可靠性取决于采样瓶、培养基、培养温度、封口效果、对照设置、紫外灯状态和人员判读。

若阴性对照出现黄色或荧光，提示培养基、操作或环境污染；若阳性对照不显色或无荧光，提示培养基、菌株或培养条件异常，本次检测结果不应报告。

十、常见异常与排查

十一、酶底物培养基的质量关注点

酶底物培养基是方法成功的核心。其质量不仅取决于营养成分，还取决于酶底物稳定性、选择剂平衡、干粉溶解性和批间一致性。

对于培养基生产或采购验收，应使用代表性阳性菌株和阴性菌株进行性能确认。仅凭外观和干粉状态不能判断酶底物培养基是否合格。

十二、与多管发酵法和滤膜法的比较

实际选择方法时，应根据水样类型、检测目的、标准要求、实验室设备和成本综合判断。对于生活饮用水常规检测，酶底物法因效率高、判读相对明确，越来越常用。

十三、记录和报告要求

酶底物法检测应完整记录采样、试剂、培养、判读和结果计算信息，确保结果可追溯。

报告时应明确方法名称、检测项目、结果单位和判定依据。定性结果可报告“未检出/100 mL”或“检出/100 mL”；定量结果可报告MPN/100 mL。

结语

酶底物法是生活饮用水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测的成熟方法。其优势是可在同一份100 mL水样中同时判断两个指标，操作简便，检测时间通常为18 h～24 h，可疑结果可延长至28 h判读。培养后出现黄色通常提示总大肠菌群阳性，黄色并伴随365 nm紫外荧光通常提示大肠埃希氏菌阳性。该方法虽然减少了传统确认步骤，但并不意味着可以忽视采样、培养基质量、对照设置、培养温度、封口效果和结果判读。对于生活饮用水卫生评价，应结合GB 5749—2022和GB/T 5750.12—2023等现行标准进行检测和报告。