酿酒酵母菌检验标准操作程序解析：样品制备、平板计数与鉴定要点

酿酒酵母，学名 Saccharomyces cerevisiae，是一类常见的功能性酵母菌，广泛应用于发酵食品、饲料添加剂、生物制品、益生菌相关产品和酿造工业中。在功能性微生物产品中，酿酒酵母菌的检测既要确认其是否存在，也要在需要时进行定量计数，以评价产品中目标功能菌的含量和质量稳定性。

GB/T 34224—2017《生物产品中功能性微生物检测》规定了生物产品中多种功能性微生物的检测方法，酿酒酵母菌检验通常采用“样品制备—系列稀释—孟加拉红琼脂平板培养—特征菌落计数—纯培养—形态学和生化鉴定—结果计算与报告”的流程。该方法的核心是先通过选择适宜培养条件获得酵母菌特征菌落，再通过镜检和生化鉴定确认其为酿酒酵母菌。

一、检测对象与方法思路

酿酒酵母菌检验既可用于定性判断，也可用于定量计数。定性报告通常表示在 25 g 或 25 mL 样品中是否检出酿酒酵母菌；定量报告则以 CFU/g 或 CFU/mL 表示样品中酿酒酵母菌数量。

与普通霉菌和酵母菌计数不同，酿酒酵母菌检验不只是计算所有酵母样菌落，而是要从平板上挑取符合特征的菌落进行确认，再根据确认比例换算目标菌数量。因此，菌落计数与鉴定确认缺一不可。如果只看孟加拉红平板上的红色酵母样菌落，可能会把其他酵母或真菌误计为酿酒酵母。

二、主要设备与材料

除微生物实验室常规灭菌、接种和培养设备外，酿酒酵母菌检验还需要恒温培养箱、均质器、振荡器、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌培养皿、显微镜和 pH 检测工具等。

需要注意的是，酵母菌培养通常采用普通需氧培养条件。原资料中“厌氧培养箱”表述不宜直接沿用，除非具体标准或实验目的明确要求特殊气体条件。常规酿酒酵母菌平板计数可在 28℃±1℃培养箱中培养。

三、培养基和试剂的作用

酿酒酵母菌检验主要使用孟加拉红琼脂培养基、麦芽汁液体培养基、无菌生理盐水和酵母菌生化鉴定试剂盒。

孟加拉红琼脂常用于霉菌和酵母菌计数，其中孟加拉红有助于限制霉菌菌落扩散，使酵母菌落更易观察。麦芽汁培养基富含可利用糖类和营养物质，适合酿酒酵母菌恢复和增殖。

四、样品制备：先获得均匀的 1:10 样品匀液

固体和半固体样品取 25 g，加入含 225 mL 无菌生理盐水 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；也可放入盛有 225 mL 无菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。

液体样品应先充分摇匀，再用无菌吸管吸取 25 mL，加入装有 225 mL 无菌生理盐水 的无菌锥形瓶中，瓶内可预置适量无菌玻璃珠，充分振摇，制成 1:10 样品匀液。

样品制备是影响结果准确性的第一步。对于含颗粒、膏状、粉状或高黏度样品，若均质不充分，酵母菌分布不均，会导致平行平板差异变大，甚至低估目标菌数量。液体样品若静置后有沉淀或分层，应充分混匀后再取样。

五、样品稀释：每递增一次稀释都要更换吸管或吸头

用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 无菌生理盐水 的无菌试管中。吸管或吸头尖端不要触及稀释液面，随后振摇试管或用新的无菌吸管反复吹打混匀，制成 1:100 样品匀液。

按同样方法继续制备 10 倍递增稀释液。每递增稀释一次，应更换新的 1 mL 无菌吸管或吸头，避免高浓度样品带入低浓度稀释管，造成计数偏高。

稀释度选择应根据样品预计菌含量确定。若样品为高活菌产品，应适当做到较高稀释度；若目标菌含量较低，则应保留低稀释度接种，以免平板菌落数过少。

六、平板接种与培养

根据对待检样品菌含量的估计，选择 2～3 个连续适宜稀释度。每个稀释度吸取 0.2 mL 样品匀液，接种于孟加拉红琼脂平板表面，用无菌涂布棒尽可能快速、均匀地涂布于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种 2 个平板。

涂布完成后，将平板静置约 10 min，使接种液完全被培养基吸收。随后翻转平皿，置 28℃±1℃培养 72h±2h。

涂布平板法的关键是接种液体积准确、涂布均匀、吸收充分。若平板表面水分过多或接种液未完全吸收，菌落可能融合或扩散，影响计数；若涂布棒接触皿边或操作时间过长，则可能造成污染或菌液分布不均。

七、特征菌落计数

培养结束后，选择特征菌落数在 10 CFU～150 CFU 之间、且无蔓延菌落生长的平板进行计数。低于 10 CFU 的平板记录具体菌落数；大于 150 CFU 的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若其中一个平板有较大片状菌落生长，该平板不宜采用，可使用同一稀释度中无片状菌落的平板作为该稀释度菌落数。若片状菌落不到平板一半，而其余一半菌落分布均匀，可计算未受影响半个平板菌落数后乘以 2，代表整个平板菌落数，但应在原始记录中注明。

酿酒酵母菌在孟加拉红琼脂上通常表现为较大、红色、平滑、边缘较整齐的酵母样菌落。需要注意，平板上类似特征的菌落并不一定全部为酿酒酵母，因此后续挑选和鉴定非常重要。

八、菌落挑选、纯培养与鉴定

从平板上挑选 5 个菌落大、红色、平滑、边缘齐整的特征菌落，分别转入麦芽汁液体培养基中，于 28℃±1℃培养 24h～48h，再进行形态学和生化鉴定。

1. 形态学鉴定

取纯培养物制片镜检。酿酒酵母细胞通常呈卵圆形或圆形，可单个、成双或成簇排列，多边芽殖。细胞大小常见约为数微米级，原资料中“直径 5.0 μm×10.0 μm”的表述更适合理解为细胞大小约 5.0 μm～10.0 μm，不宜写作单一“直径×直径”。

形态学观察可帮助区分酵母与霉菌、细菌或混合污染，但不能单独作为最终鉴定依据。不同酵母属种在形态上可能相似，因此仍需结合生化鉴定。

2. 生化鉴定

使用酵母菌生化鉴定试剂盒进行确认。生化鉴定通常基于酵母对不同糖类、氮源或其他底物的发酵、同化和代谢特征。若结果符合酿酒酵母菌鉴别特征，可判定为酿酒酵母菌。

若平板特征、镜检形态和生化结果不一致，应重新纯化、重复鉴定，必要时可采用分子方法或质谱方法辅助确认。

九、目标菌数量如何计算？

由于平板上的特征菌落并非全部一定是酿酒酵母菌，因此需先根据挑选鉴定结果计算每个平板中经确认的酿酒酵母菌菌落数。

计算公式为：

a = b / A × C

其中，a 为每块平板上的酿酒酵母菌菌落数；b 为挑取后经证实为酿酒酵母菌的菌落数；A 为挑取平板上用于验证的菌落数；C 为该平板上的所有特征菌落数。

例如，某平板上共有 80 个特征菌落，挑取 5 个进行鉴定，其中 4 个确认为酿酒酵母菌，则该平板中酿酒酵母菌菌落数为：

a = 4 / 5 × 80 = 64 CFU

再根据稀释倍数和接种体积换算样品中酿酒酵母菌数量。由于本方法每皿接种量为 0.2 mL，实际计算时应注意接种体积对换算系数的影响。实验室在建立 SOP 时，应明确 CFU/g 或 CFU/mL 计算公式，避免遗漏 0.2 mL 接种体积因素。

若只有一个稀释度平板的菌落数在适宜计数范围内，可计算两个平板中酿酒酵母菌菌落数的平均值，再乘以相应稀释倍数和接种体积换算系数，作为每克或每毫升样品中的结果。

若两个连续稀释度平板菌落数均在适宜计数范围内，可按平板计数常用加权公式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；ΣC 为纳入计算平板的酿酒酵母菌菌落数之和；n₁ 为第一稀释度平板个数；n₂ 为第二稀释度平板个数；d 为第一稀释度稀释因子。若采用 0.2 mL 涂布法，计算时还应按方法或 SOP 纳入接种体积校正。

十、结果判定与报告

若样品菌落符合酿酒酵母菌的形态学和生化鉴定特征，可判定为酿酒酵母菌。

定性报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出酿酒酵母菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出酿酒酵母菌。

定量报告时，菌落数小于 100 CFU 时，以整数报告；菌落数大于或等于 100 CFU 时，对第 3 位数字进行修约后保留前 2 位数字，后面用 0 代替位数，也可用 10 的指数形式表示，采用两位有效数字。例如 12600 CFU/g 可报告为 1.3×10⁴ CFU/g。

十一、常见问题与注意事项

第一，培养条件应写作普通培养或需氧培养，不宜写成厌氧培养。酿酒酵母虽可进行发酵代谢，但平板计数通常不需要厌氧培养箱。

第二，涂布量为 0.2 mL，结果换算时必须考虑接种体积。如果只乘稀释倍数而忽略 0.2 mL，会造成结果低估。

第三，特征菌落不等于目标菌。必须挑取菌落进行纯培养、镜检和生化鉴定，再按证实比例计算目标菌数量。

第四，孟加拉红琼脂可限制霉菌蔓延，但不能完全抑制所有非目标酵母或霉菌。若平板上霉菌蔓延严重，应按计数规则处理，必要时重新选择稀释度。

第五，样品必须充分均质。功能性微生物产品中菌体可能分布不均，尤其是粉末、颗粒、膏状或半固体样品，均质不足会影响平行性。

第六，每递增一个稀释度都应更换无菌吸管或吸头，防止交叉带菌。

第七，生化鉴定试剂盒应在有效期内使用，并设置必要质控。若鉴定结果不典型，应复核纯培养物纯度。

第八，培养基质量会直接影响计数结果。孟加拉红琼脂应支持酵母生长并限制霉菌扩散；麦芽汁液体培养基应能促进酵母恢复和增殖。

十二、小结

酿酒酵母菌检验适用于生物产品中功能性微生物的定性和定量检测。该方法以无菌生理盐水制备样品匀液，经系列稀释后取 0.2 mL 涂布于孟加拉红琼脂平板，在 28℃±1℃培养 72h±2h，选择 10 CFU～150 CFU 的特征菌落平板计数，再挑取典型菌落进行麦芽汁液体培养、镜检和生化鉴定。

该方法的关键在于：样品充分均质、稀释准确、平板涂布均匀、培养条件正确、特征菌落必须经鉴定确认，并按确认比例进行结果换算。对于功能性微生物产品而言，酿酒酵母菌检测不仅是计数过程，更是目标菌身份确认和产品质量评价的重要环节。