DNA-DNA 杂交同源性测定：从传统分类方法到基因组时代的应用

在细菌分类鉴定中，形态观察、生理生化反应、G+C 含量和 16S rRNA 基因序列分析都能提供重要信息。但对于亲缘关系很近的菌株，仅靠这些指标有时难以判断它们是否属于同一个种。传统微生物分类学中，DNA-DNA 杂交同源性测定曾是判断原核生物种水平关系的重要方法之一。

DNA-DNA 杂交，也称 DNA-DNA hybridization，简称 DDH。它通过比较两个菌株全基因组 DNA 之间的互补配对程度，评价二者基因组整体相似性。简单来说，如果两个菌株的 DNA 序列高度相似，变性后的单链 DNA 在适宜条件下更容易重新结合形成双链；如果序列差异较大，杂交程度就会降低。

一、DNA-DNA 杂交测定的基本原理

DNA 双链依靠碱基互补配对结合。当双链 DNA 经高温或化学条件处理后，氢键断裂，形成单链 DNA，这一过程称为变性。若将变性后的单链 DNA 在合适温度、盐浓度和缓冲条件下缓慢冷却或恒温孵育，互补序列又可以重新结合，这一过程称为复性。

DNA-DNA 杂交正是利用这一特性。将菌株 A 和菌株 B 的 DNA 分别提取、剪切、变性，再混合复性。如果 A 与 B 的基因组序列相似，二者的单链 DNA 能形成较多杂交双链；如果差异较大，杂交比例则较低。通过测定复性速度、结合量或标记 DNA 的杂交信号，即可估算两菌株之间的 DNA 同源性。

传统分类学中，通常认为两个菌株 DNA-DNA 杂交值达到约 70% 或以上，并结合其他分类学证据，可支持其归为同一种。需要注意的是，70% 并不是孤立的绝对标准，还应结合表型特征、系统发育关系、生态来源和模式菌株比较等信息综合判断。

二、样品制备：DNA 质量决定结果可靠性

DNA-DNA 杂交测定的前提是获得高质量 DNA。一般需要先进行菌体收集和 DNA 提取，并对 DNA 的纯度、浓度和完整性进行检查。DNA 中若残留蛋白质、多糖、RNA、盐类或酚类物质，可能影响变性、复性和杂交结果。

传统方法中，提取后的 DNA 常需要剪切成合适大小的片段。片段过长会影响复性动力学，片段过短则可能降低特异性。早期实验常通过超声处理使 DNA 断裂到适宜范围，再用紫外分光光度法测定 OD260，调整 DNA 浓度。

样品制备阶段还要注意 DNA 之间浓度一致。若菌株 A、菌株 B 及混合样品的 DNA 浓度差异较大，复性速度或杂交信号就可能受到浓度影响，从而造成同源性估算偏差。

三、复性率法：通过复性速度估算同源性

复性率法是早期应用较多的 DNA-DNA 同源性测定方法之一。其核心思路是：同源或高度相似的 DNA 单链复性较快，差异较大的 DNA 单链复性较慢。通过比较菌株 A、菌株 B 及 A+B 混合 DNA 的复性速度，可以计算二者之间的同源性百分数。

实验中通常先将待测 DNA 剪切至适宜大小，并配制成一定浓度的 DNA 溶液。菌株 A 和菌株 B 分别作为单独样品，同时取等量 A、B DNA 混合为杂交样品。各样品经加热变性后，在适宜复性温度下进行复性反应，并用分光光度计在 260 nm 监测吸光度变化。

DNA 变性后，单链 DNA 在 260 nm 的吸光度较高；复性形成双链后，吸光度会下降。因此，在一定时间内吸光度下降的速度可反映 DNA 复性速率。根据 A、B 单独样品和混合样品的复性速率，可以推算 A 与 B 的 DNA 同源性。

复性率法的优点是设备要求相对传统，理论直观；缺点是对 DNA 纯度、片段大小、温度控制、盐浓度和仪器稳定性要求较高。若实验条件控制不严，重复性和实验室间可比性容易受到影响。

四、固相分子杂交法：通过标记信号计算同源性

固相分子杂交法也是传统 DNA-DNA 同源性测定中常用的方法。其基本思路是将一种 DNA 固定在滤膜等载体上，再用标记的另一种 DNA 与其杂交，通过检测标记信号强度计算同源性。

传统方法中，DNA 可先经加热变性，再吸附到微孔滤膜上并固定。另一菌株 DNA 则进行同位素或其他方式标记。标记 DNA 与膜上固定 DNA 在一定盐浓度、温度和表面活性剂条件下孵育，互补程度越高，结合在膜上的标记 DNA 越多。洗膜后测定信号强度，并与同源对照比较，即可计算两菌株 DNA-DNA 杂交百分数。

固相杂交法的优点是可以较直接比较标记 DNA 与不同固定 DNA 的结合量，适合多个样品比较。但早期同位素标记方法对实验条件、放射性安全和废物处理要求较高，现在常规实验室已较少采用。后续也发展出非放射性标记或荧光检测方法，但在细菌分类学中，传统湿实验 DDH 已逐渐被基因组计算方法取代。

五、同源性结果如何理解？

DNA-DNA 杂交结果通常以百分数表示。例如，菌株 A 的标记 DNA 与自身 DNA 杂交信号作为 100% 对照，菌株 A 与菌株 B 的杂交信号与该对照相比，即可得到 A 与 B 的同源性百分数。

一般来说：

需要强调的是，DDH 结果不是唯一分类依据。两个菌株即使 DDH 接近或超过 70%，也应考察其表型特征是否一致、是否与模式菌株对应、是否存在明显生态或临床差异。相反，DDH 略低于 70% 的边缘结果，也需要结合基因组和表型信息谨慎判断。

六、DNA-DNA 杂交与 G+C 含量、16S rRNA 的关系

G+C 含量可以反映基因组中鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例，但它只是总体碱基组成指标。两个菌株 G+C 含量相近，并不代表序列相似；两个菌株 G+C 含量差异较大，则通常提示亲缘关系较远。因此，G+C 含量可用于辅助分类，但不能替代 DNA-DNA 杂交。

16S rRNA 基因序列分析常用于判断细菌系统发育关系，适合属水平或较高分类单元的识别。但对于某些近缘种，16S rRNA 序列相似度可能非常高，甚至超过 99%，仍不能准确区分是否属于同一种。此时，传统分类学中常需要进一步进行 DDH；在现代分类中，则更多采用全基因组 ANI 或 dDDH 分析。

七、现代替代方法：ANI 与 dDDH

随着基因组测序成本下降，传统湿实验 DNA-DNA 杂交已逐渐被基因组计算方法替代。常用方法包括 ANI（Average Nucleotide Identity，平均核苷酸一致性） 和 dDDH（digital DNA-DNA hybridization，数字 DNA-DNA 杂交）。

ANI 通过比较两个基因组中同源片段的平均序列一致性来评价相似度。研究表明，传统 DDH 约 70% 的物种界限通常对应 ANI 约 95%～96%。dDDH 则通过计算模型模拟传统 DDH 的结果，输出与传统 DDH 类似的百分比值，便于与既往分类标准衔接。

与传统 DDH 相比，ANI 和 dDDH 的优点是重复性更好、数据可追溯、无需放射性标记，也便于跨实验室比较。对于新种描述、菌株归属判断和近缘菌比较，全基因组分析已成为越来越重要的工具。不过，基因组方法仍需要高质量测序数据、可靠的参考基因组和合理的分类学解释。

八、传统 DNA-DNA 杂交的局限性

DNA-DNA 杂交曾是原核生物种水平划分的“金标准”，但它也存在明显局限。首先，实验操作复杂，对 DNA 质量、片段大小、反应温度和离子强度高度敏感。其次，不同实验室之间结果可比性有限，同一菌株组合在不同方法下可能出现一定差异。第三，放射性标记固相杂交方法涉及安全管理和废物处理，操作门槛较高。

此外，DDH 给出的是整体相似性百分数，并不能直接告诉我们哪些基因相同、哪些基因不同，也无法揭示基因获得、缺失、毒力因子、耐药基因或代谢通路差异。相比之下，全基因组测序不仅能提供相似性指标，还能进一步分析系统发育、功能基因和生态适应性。

九、在培养基和菌种鉴定中的意义

对于培养基企业和微生物实验室而言，了解 DNA-DNA 杂交的意义，有助于理解菌种分类和标准菌株命名的来源。许多经典菌种名称、模式菌株确认和近缘种划分，最初都曾依赖 DDH 数据。

在实际检测中，培养基质量控制通常不需要实验室自行开展 DNA-DNA 杂交。但当遇到菌株鉴定结果与传统生化反应不一致、近缘菌难以区分、标准菌株名称发生变更或需要进行新菌株分类研究时，DDH、ANI、dDDH 等基因组相似性指标就具有重要参考价值。

尤其在现代微生物分类中，单一表型差异已不足以支持新种或种内归属判断。更可靠的做法是结合 16S rRNA、全基因组 ANI、dDDH、系统发育树、表型特征和生态来源进行多相分类分析。

十、小结

DNA-DNA 杂交同源性测定是一种通过比较两个菌株全基因组 DNA 互补程度来判断亲缘关系的传统方法。其基本原理是 DNA 变性后可按序列互补程度重新复性，序列越相似，杂交程度越高。传统分类学中，约 70% DDH 常被作为原核生物同种划分的重要参考界限。

常见传统方法包括复性率法和固相分子杂交法。前者通过测定 DNA 复性速度估算同源性，后者通过标记 DNA 与固定 DNA 的杂交信号计算同源性。由于操作复杂、重复性和安全性限制，传统湿实验 DDH 目前已逐渐被 ANI 和 dDDH 等基因组计算方法替代。

总体来看，DNA-DNA 杂交是理解细菌分类学发展史的重要技术，也是现代基因组分类方法的基础之一。今天在菌种鉴定和分类研究中，更推荐结合全基因组数据和表型特征进行综合判断。