屎肠球菌检验标准操作程序解析：选择性平板计数、鉴定与结果报告

屎肠球菌，学名 Enterococcus faecium，属于肠球菌属，是一类革兰氏阳性球菌。它既可作为功能性微生物用于部分生物产品或饲用微生态制剂，也可能作为环境、肠道来源微生物出现在不同样品中。因此，在功能性微生物产品质量控制中，屎肠球菌检验不仅要计数，还要确认平板上的特征菌落是否确实为目标菌。

依据 GB/T 34224—2017《生物产品中功能性微生物检测》，屎肠球菌检验通常采用“样品制备—系列稀释—选择性平板涂布培养—特征菌落计数—纯培养—革兰染色镜检—生化鉴定—结果计算与报告”的流程。该方法的重点是：不能仅凭平板颜色和菌落形态直接计为屎肠球菌，而应挑取特征菌落进一步确认，再按确认比例换算目标菌数量。

一、方法原理与检测思路

屎肠球菌检验可用于定性判断和定量计数。定性报告用于说明 25 g 或 25 mL 样品中是否检出屎肠球菌；定量报告则用于评价样品中目标菌数量，通常以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。

屎肠球菌选择性培养基用于抑制部分非目标菌，并使屎肠球菌形成较典型的暗红色至粉红色菌落。由于其他肠球菌或部分耐受性较强的革兰阳性球菌也可能形成相似菌落，因此本方法采用“特征菌落计数 + 挑取鉴定 + 比例换算”的方式，降低误计风险。

二、主要设备与材料

除微生物实验室常规灭菌、培养和无菌操作设备外，本方法还需要恒温培养箱或恒温厌氧培养箱、冰箱、天平、均质器、振荡器、无菌吸管或移液器、无菌锥形瓶、无菌培养皿、显微镜和 pH 检测工具等。

肠球菌为兼性厌氧菌，在普通培养和厌氧条件下均可生长。原方法中使用“厌氧培养箱”培养 48h±2h，应按标准或实验室 SOP 执行；若实验室采用普通培养箱，应通过方法适用性确认，确保目标菌回收率和选择性符合要求。

三、培养基和试剂的作用

屎肠球菌检验常用屎肠球菌选择性培养基、肠球菌肉汤、无菌生理盐水、革兰氏染色液和细菌生化鉴定试剂盒。

选择性平板只能提供初步筛选。最终判定仍需结合革兰染色和生化鉴定结果，必要时还可采用分子鉴定、质谱鉴定等方法复核。

四、样品制备：先制成均匀的 1:10 样品匀液

固体和半固体样品取 25 g，置于含 225 mL 无菌生理盐水 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；也可置于含 225 mL 无菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。

液体样品应先充分摇匀，再用无菌吸管吸取 25 mL，加入装有 225 mL 无菌生理盐水 的无菌锥形瓶中。锥形瓶内可预置适量无菌玻璃珠，充分振摇后制成 1:10 样品匀液。

样品制备必须充分均匀。功能性微生物产品中菌体可能吸附在粉末颗粒、载体、蛋白物料或油脂样成分中，若均质不足，会导致平行平板菌落数差异大，影响结果可靠性。

五、样品稀释：逐级 10 倍递增

用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 无菌生理盐水 的无菌试管中。吸管尖端不要触及稀释液面，随后振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打混匀，制成 1:100 样品匀液。

继续进行 10 倍递增稀释时，每递增一次稀释，都应更换新的 1 mL 无菌吸管或吸头，防止高浓度样品带入低浓度稀释管，造成结果偏高。

稀释度选择应根据样品中屎肠球菌的预估含量确定。若产品标示活菌数较高，应设置较高稀释度；若目标菌含量不确定，应选择 2～3 个连续适宜稀释度，以保证至少有一个稀释度落入可计数范围。

六、平板接种与培养

根据待检样品菌含量估计，选择 2～3 个连续适宜稀释度。每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液，接种于屎肠球菌选择性平板表面，用无菌涂布棒小心、快速、均匀地涂布于琼脂表面。涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种 2 个平板。

涂布后，将平板静置约 10 min，使接种物完全被培养基吸收。随后翻转平皿，置 37℃±1℃厌氧培养箱中培养 48h±2h。

培养时应注意平板表面干湿状态。若平板过湿，接种液不易吸收，菌落可能融合或沿平板表面扩散；若平板过干，可能影响目标菌恢复和典型菌落形成。

七、特征菌落计数

培养结束后，选择特征菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、且无蔓延菌落生长的平板进行计数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数；大于 300 CFU 的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若其中一个平板有较大片状菌落生长，该平板不宜采用，应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度菌落数。若片状菌落不到平板面积的一半，而其余一半中菌落分布均匀，可计算半个平板后乘以 2，代表该平板菌落数，但应在原始记录中注明。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，可将每条单链作为一个菌落计数。该规则适用于链状排列或沿涂布方向形成连续链状生长的情况，避免将同一来源的连续链状生长误拆分为多个独立菌落。

屎肠球菌在选择性平板上的可疑特征菌落通常为 暗红色至粉红色、表面光滑凸起、周边整齐。但这些特征并非绝对，仍需后续鉴定确认。

八、菌落挑选、纯培养与鉴定

1. 菌落挑选和纯培养

从平板上挑选 5 个暗红色至粉红色、表面光滑凸起、周边整齐的可疑菌落，分别转入肠球菌肉汤培养基中，于 37℃±1℃培养 24h±2h，再进行形态学和生化鉴定。

挑取多个菌落有助于提高结果代表性。若平板上可疑菌落形态不完全一致，应优先挑取典型和可疑菌落分别确认，避免漏检或误计。

2. 形态学鉴定

取纯培养物进行革兰氏染色并镜检。屎肠球菌应为 革兰氏阳性球菌，呈球形或椭圆形，直径约 0.6 μm～2.5 μm，常成对或短链状排列，无芽胞。

若镜检发现革兰氏阴性菌、杆菌、芽胞菌或明显混合菌形态，说明该菌落不符合屎肠球菌基本特征，或纯培养不充分，应重新分离纯化。

3. 生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行菌种确认。肠球菌属常见菌种之间形态相近，单靠革兰染色不能区分粪肠球菌、屎肠球菌及其他肠球菌。因此，屎肠球菌确认应结合糖发酵、酶反应、耐受性试验或商品化鉴定系统结果。

若形态学和生化鉴定结果均符合屎肠球菌特征，可判定为屎肠球菌。若结果不一致，应重新纯化后复测，必要时采用质谱或分子方法进一步确认。

九、目标菌数量如何计算？

由于平板上的特征菌落不一定全部为屎肠球菌，需要先根据挑取鉴定结果换算每块平板上的目标菌数量。计算公式为：

a = b / A × C

其中，a 为每块平板上的屎肠球菌菌落数；b 为挑取后经证实为屎肠球菌的菌落数；A 为挑取平板上用于验证的菌落数；C 为平板上的所有特征菌落数。

例如，某平板上共有 120 个特征菌落，挑取 5 个进行鉴定，其中 4 个确认为屎肠球菌，则该平板目标菌菌落数为：

a = 4 / 5 × 120 = 96 CFU

若只有一个稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中屎肠球菌菌落数的平均值，再根据稀释倍数和接种体积换算为每克或每毫升样品中的菌落总数。

若两个连续稀释度平板菌落数均在适宜计数范围内，应采用加权公式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；ΣC 为纳入计算平板的屎肠球菌菌落数之和；n₁ 为第一稀释度，即低稀释倍数平板个数；n₂ 为第二稀释度，即高稀释倍数平板个数；d 为第一稀释度稀释因子。

需要特别注意，本方法每皿涂布量为 0.1 mL。若标准公式中的 d 未包含接种体积校正，实验室在换算 CFU/g 或 CFU/mL 时应明确乘以相应体积校正系数，避免低估结果。

十、结果判定与报告

若样品菌落符合屎肠球菌形态学及生化鉴定特征，可判定为屎肠球菌。

定性报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出屎肠球菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出屎肠球菌。

定量报告时，菌落数小于 100 CFU 时，以整数报告；菌落数大于或等于 100 CFU 时，对第 3 位数字进行修约后保留前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式表示，并采用两位有效数字。例如 12600 CFU/g 可报告为 1.3×10⁴ CFU/g。

十一、常见问题与注意事项

第一，选择性平板上的粉红色或暗红色菌落只是可疑菌落，不能直接报告为屎肠球菌，必须经形态学和生化鉴定确认。

第二，涂布量为 0.1 mL，结果换算时必须考虑接种体积。如果只乘稀释倍数，可能造成结果低估。

第三，原始公式应写成除法形式，即 N=ΣC/[(n₁+0.1n₂)×d]。若写成乘法形式，会导致计算逻辑错误。

第四，肠球菌常成对或短链状排列，平板上出现链状生长时，应按方法规定将每条单链作为一个菌落计数。

第五，样品必须充分均质。粉末、颗粒、半固体或含载体样品若分散不充分，会导致平行结果差异较大。

第六，每次递增稀释应更换无菌吸管或吸头，避免交叉带菌。

第七，厌氧培养条件应按标准或实验室 SOP 执行。若改用普通培养条件，应经过验证。

第八，生化鉴定试剂盒应在有效期内使用，并按说明书判读。肠球菌种间差异不应仅凭镜检判断。

十二、小结

屎肠球菌检验是功能性微生物产品质量控制中的重要项目。该方法以无菌生理盐水制备样品匀液，经系列稀释后取 0.1 mL 涂布于屎肠球菌选择性平板，在 37℃±1℃培养 48h±2h，选择 30 CFU～300 CFU 的特征菌落平板进行计数，并挑取典型菌落进行肠球菌肉汤纯培养、革兰染色镜检和生化鉴定。

该方法的关键在于：样品制备充分、稀释准确、涂布均匀、培养条件符合要求、特征菌落经鉴定确认后再换算目标菌数量。对于功能性微生物检测而言，屎肠球菌的结果不能只依赖平板颜色，而应结合菌落形态、显微形态和生化鉴定结果综合判断。