副溶血性弧菌检验的样品制备：GB 4789.7-2013操作要点解读

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见于海水、水产品及其加工环境中的食源性致病菌。由于该菌具有嗜盐性，且对样品保存温度、解冻方式、取样部位和增菌培养基盐浓度较为敏感，样品制备是否规范会直接影响后续检出率。

GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》中，样品制备是整个检测流程的基础步骤。它的目的不是简单“取25 g样品加225 mL稀释液”，而是要尽可能保留目标菌活性、选择有代表性的污染部位，并利用3%氯化钠碱性蛋白胨水制备适合副溶血性弧菌恢复和增殖的1:10样品匀液。

一、样品保存：尽快检验，避免目标菌损伤

非冷冻样品采集后，应立即置于7 ℃～10 ℃条件下保存，并尽可能及早检验。副溶血性弧菌来源多与水产品有关，样品在不适宜温度下放置过久，既可能导致背景菌增殖，也可能造成目标菌数量变化，从而影响检验结果。

冷冻样品应控制解冻条件，可在45 ℃以下不超过15 min快速解冻，或在2 ℃～5 ℃条件下不超过18 h缓慢解冻。解冻过程不宜过热、过久，也应避免反复冻融。过度加热可能损伤目标菌，长时间解冻则可能改变样品微生物状态。

样品保存环节看似简单，却是副溶血性弧菌检验中非常关键的一步。尤其是水产品样品，采样、运输、保存和解冻过程都应记录清楚，便于结果追溯。

二、不同水产品的取样部位

副溶血性弧菌在不同水产品中的分布并不完全一致，因此取样部位应根据样品类型选择。鱼类和头足类动物通常取表面组织、肠或鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类可取整个动物，或取动物中心部分，包括肠和鳃。

正确取样的核心是“代表性”。如果只取样品表面或只取可食肌肉，而忽略肠、鳃、体液等高风险部位，可能导致漏检或低估污染水平。

三、带壳样品为什么要先洗刷外壳？

对于带壳贝类或甲壳类，应先在自来水中洗刷外壳，并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，再按要求取相应部分。这样做的目的，是减少外壳泥沙、附着物和环境微生物对内容物取样的干扰。

需要注意的是，外壳清洗只是去除外表面污物，并不是对样品进行消毒。打开外壳时仍需采用无菌器械，避免外壳表面污染物进入贝肉、体液或内部组织中。若开壳过程不规范，可能造成假阳性或结果偏高。

四、1:10样品匀液的制备

以无菌操作取样品25 g或25 mL，加入225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水，制备成1:10样品匀液。可使用旋转刀片式均质器，以8000 r/min均质1 min；也可使用拍击式均质器拍击2 min。

3%氯化钠碱性蛋白胨水是副溶血性弧菌检验中的重要培养基。其3%氯化钠满足副溶血性弧菌嗜盐性，碱性环境有利于弧菌恢复和增殖，蛋白胨提供氮源和营养物质。与普通生理盐水或一般稀释液相比，该培养基更适合副溶血性弧菌样品制备和增菌。

样品匀液应充分均一。若样品颗粒较大、含壳碎片或组织结构致密，均质不充分会影响目标菌释放，导致结果偏低。

五、没有均质器时如何处理？

如无均质器，可将样品放入无菌乳钵中。先从225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入乳钵，将样品充分研磨。样品磨碎后转移至500 mL无菌锥形瓶中，再用少量稀释液冲洗乳钵中残留样品1次～2次，洗液一并倒入锥形瓶。最后将剩余稀释液全部加入锥形瓶中，充分振荡，制备成1:10样品匀液。

手工研磨法应特别注意无菌操作和样品损失。乳钵、研杵、锥形瓶和稀释液均应无菌，转移过程应尽量完整，避免样品残留影响最终稀释比例。

六、为什么必须使用3%氯化钠碱性蛋白胨水？

副溶血性弧菌与许多食品致病菌不同，它具有明显嗜盐性。若使用不含盐或盐浓度不适宜的稀释液，可能影响其生存、恢复和增殖。3%氯化钠碱性蛋白胨水兼具稀释、恢复和选择性增菌作用，是该菌检验样品制备中的关键培养基。

因此，不能随意用普通生理盐水、缓冲蛋白胨水或其他稀释液替代。若培养基盐浓度、pH或灭菌条件异常，可能导致副溶血性弧菌恢复不良或背景菌干扰增加。

七、样品制备中的常见问题

八、培养基质量控制要点

副溶血性弧菌样品制备高度依赖3%氯化钠碱性蛋白胨水。该培养基应重点控制盐浓度、pH、无菌性和促生长能力。盐浓度偏低可能不利于嗜盐菌恢复，偏高则可能抑制部分受损菌；pH不合适也会影响弧菌选择性增殖效果。

对于培养基生产和使用实验室，应使用质控菌株验证培养基促生长能力，并检查外观、pH、澄清度和灭菌状态。培养基应无沉淀、无污染，灭菌后pH应符合标准或产品要求。用于定量检测时，培养基批间一致性尤其重要，因为它会影响MPN结果稳定性。

九、样品制备与后续检测的关系

样品制备完成后，1:10样品匀液可用于定性增菌，也可进一步进行10倍系列稀释用于定量检测。若样品制备阶段出现取样偏差、稀释比例错误、均质不足或培养基不合格，后续TCBS分离、弧菌显色培养基筛选、生化鉴定和MPN计算都会受到影响。

因此，副溶血性弧菌检验的准确性，不仅取决于后续选择性平板和鉴定试验，更取决于样品制备是否规范。样品制备是定性“检出/未检出”和定量“污染水平估算”的共同基础。

小结

副溶血性弧菌检验的样品制备应围绕三个关键点展开：保存温度要合适，取样部位要有代表性，1:10样品匀液要用3%氯化钠碱性蛋白胨水规范制备。非冷冻样品采集后应置7 ℃～10 ℃保存并尽快检验；冷冻样品应在规定条件下解冻，避免过热或反复冻融。鱼类、头足类、贝类和甲壳类应按污染风险选择表面组织、肠、鳃、贝肉、体液或中心部分等代表性部位。

制备样品匀液时，应以无菌操作取25 g或25 mL样品，加入225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水，采用均质器或手工研磨法充分处理，形成均匀的1:10样品匀液。实际检验应严格按照GB 4789.7-2013等现行有效标准执行，并做好培养基质量控制和样品信息记录。