枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备方法与质量控制要点

枯草杆菌黑色变种芽孢是消毒效果评价中常用的指示微生物之一。由于细菌芽孢对热、干燥、紫外线和多种化学消毒因子具有较强抵抗力，常被用于评价消毒剂、灭菌方法或消毒工艺对芽孢类微生物的杀灭能力。在 WS/T 683—2020《消毒试验用微生物要求》中，枯草杆菌黑色变种芽孢可作为细菌芽孢代表，常用菌株为 ATCC 9372。

从名称上看，“枯草杆菌黑色变种”属于传统表述，常见拉丁名为 Bacillus subtilis var. niger。在现代分类和实际应用中，该类菌株也常与 Bacillus atrophaeus 相关联。为便于标准执行和行业沟通，消毒试验中仍可按标准名称“枯草杆菌黑色变种芽孢”表述，同时在技术资料中注明菌株编号和现代分类信息。

一、为什么要制备芽孢悬液？

消毒试验中使用的菌悬液需要具有稳定、可重复的微生物数量和抵抗力。普通细菌繁殖体对环境和消毒因子较敏感，而芽孢具有较强耐受性，更适合用于评价高水平消毒或灭菌效果。

枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的制备，核心目标是获得数量明确、纯度较高、芽孢形成率高、分散性好的芽孢液。合格的芽孢悬液应尽量减少营养细胞、培养基碎屑、琼脂小块和杂菌污染，使用前还需要进行活菌计数，以确定实际试验浓度。

二、菌种复苏与传代培养

制备芽孢悬液前，应先对保存菌种进行复苏。通常在无菌条件下开启菌种管，加入适量营养肉汤培养基，轻轻吹吸数次，使冻干菌种或保存菌体充分分散。取少量菌悬液接种至含 5.0～10.0 mL 营养肉汤培养基的试管中，于 36℃±1℃培养 18～24 h，获得第 1 代培养物。

随后，用接种环取第 1 代培养物，划线接种于营养琼脂培养基平板，继续于 36℃±1℃培养 18～24 h。挑取第 2 代培养物中的典型菌落，再接种至营养肉汤培养基，于 36℃±1℃培养 18～24 h，即可作为第 3 代培养物。

这一过程的意义在于恢复菌株活力、获得典型菌落，并降低原始保存状态对后续芽孢形成的影响。用于制备芽孢悬液的培养物一般应选择第 3～5 代、18～24 h 的营养肉汤培养物。传代次数过多可能导致菌株性状变化，不利于芽孢悬液的稳定制备。

三、扩大培养与诱导芽孢形成

取第 3～5 代的 18～24 h 营养肉汤培养物 5.0～10.0 mL，接种至罗氏瓶或细胞培养瓶中的营养琼脂培养基表面。接种后轻轻摇动，使菌液均匀覆盖培养基表面，再吸出多余肉汤培养物。随后将罗氏瓶或细胞培养瓶置于 36℃±1℃恒温培养箱内培养 5～7 d。

在营养琼脂表面培养数日，是为了促使细菌由繁殖体逐渐形成芽孢。芽孢形成与营养条件、培养时间、温度、水分和菌体密度有关。培养时间不足时，营养细胞比例较高；培养时间过长或培养基过度干燥时，也可能影响芽孢活性和回收率。因此，培养过程中应关注菌苔状态和培养基表面情况，避免污染、过度干裂或异常生长。

四、芽孢形成率检查

在收集芽孢前，应检查芽孢形成率。可用接种环取少量菌苔涂布于玻片上，自然干燥后经火焰固定，再采用改良芽孢染色法染色观察。

改良芽孢染色的基本原理是利用孔雀绿对芽孢进行加热染色，再用沙黄复染营养细胞。染色后，在油镜下观察，芽孢通常呈绿色，菌体呈红色。若芽孢形成率达到 90% 以上，即可进行后续收集和纯化处理；若芽孢形成率不足，应继续在适宜条件下放置或延长培养，直至达到要求。

芽孢形成率是芽孢悬液质量控制的关键指标。若营养细胞比例过高，后续热处理或保存过程中容易出现数量波动，也会影响消毒试验结果的准确性。尤其在进行消毒剂杀灭效果评价时，芽孢悬液中繁殖体过多可能导致结果偏差。

五、芽孢收集与分散

当芽孢形成率合格后，可向罗氏瓶或细胞培养瓶中加入约 10.0 mL 无菌蒸馏水，用接种环或无菌工具轻轻刮下菌苔并吸出。随后再加入约 5.0 mL 无菌蒸馏水冲洗培养基表面，并将两次收集的菌悬液合并于含玻璃珠的无菌锥形瓶中，振摇约 5 min，使菌体和芽孢充分分散。

收集时应避免刮取过多琼脂碎块。琼脂碎块不仅会影响悬液均匀性，还可能干扰后续过滤、离心和计数。玻璃珠振摇有助于打散菌团，使芽孢悬液更均匀，有利于获得稳定的计数结果。

六、自溶、过滤与清洗

收集后的菌悬液可置于 45℃水浴中约 24 h，使残余菌体自溶、断链，并促进芽孢分散成较均一的单个状态。随后用无菌棉或纱布过滤芽孢液，以去除琼脂小块、菌苔碎片和较大的杂质。

过滤后的芽孢悬液转入无菌离心管中，以约 3000 r/min 离心 30 min。弃去上清液后，加入无菌蒸馏水吹吸混匀，使芽孢重新悬浮。离心和重悬清洗步骤通常重复 3 次，以尽量去除培养基残留、代谢产物和可溶性杂质。

清洗是否充分会影响芽孢悬液的稳定性和后续消毒试验结果。如果培养基残留过多，可能中和部分消毒剂或影响杀灭效果判断；如果芽孢团聚严重，则会导致活菌计数偏差。因此，清洗和分散是制备过程中非常重要的环节。

七、热处理与保存

洗净后的芽孢悬液可转入含适量小玻璃珠的烧瓶中，进行热处理，以杀灭残余细菌繁殖体。常用条件为 80℃水浴 10 min，或 60℃水浴 30 min。热处理后待冷却至室温，充分摇匀，再进行分装和冷藏保存。

热处理的目的不是杀灭芽孢，而是去除残余营养细胞，提高芽孢悬液纯度。由于不同菌株、不同芽孢状态和不同水浴条件下耐热性可能存在差异，实际操作中应注意温度准确性和处理时间一致性。处理后应通过计数和必要的纯度检查确认芽孢悬液质量。

制备好的芽孢悬液一般冷藏保存备用，标准资料中给出的有效使用期为 6 个月。保存期间应避免反复污染、频繁温度波动和长时间室温放置。使用前应充分混匀，并进行活菌培养计数。

八、使用前计数与污染检查

芽孢悬液在使用前必须进行活菌培养计数，以确认实际浓度。由于芽孢在保存过程中可能发生沉降、团聚或数量变化，不能仅凭制备时的浓度推算长期保存后的使用浓度。计数前应充分振摇，使芽孢悬液均匀分散。

如果怀疑芽孢悬液受到污染，应结合菌落形态、革兰染色和必要的生化试验进行鉴定。枯草杆菌黑色变种通常为芽孢杆菌类形态，若平板上出现明显不同形态菌落、真菌污染或革兰染色结果异常，应停止使用该批芽孢悬液，并按实验室质量管理程序处理。

九、制备过程中的关键控制点

枯草杆菌黑色变种芽孢悬液制备看似是简单的培养和收集过程，但影响质量的因素很多。首先，菌种来源必须清楚，应使用符合标准要求的菌株，并控制传代次数。其次，培养温度、培养时间和培养基状态会影响芽孢形成率。第三，收集、分散、过滤和离心清洗会影响芽孢悬液的均匀性和纯度。第四，热处理和保存条件会影响芽孢数量稳定性。

在消毒试验中，芽孢悬液质量直接关系到试验结果是否可靠。芽孢形成率不足、悬液团聚、浓度不准、残留营养物过多或杂菌污染，都可能导致消毒效果评价出现偏差。因此，每批芽孢悬液均应建立完整记录，包括菌株来源、传代次数、培养条件、芽孢形成率、清洗次数、热处理条件、保存日期、活菌计数和污染检查结果。

十、小结

枯草杆菌黑色变种芽孢悬液是消毒试验中常用的标准化微生物材料，主要用于评价消毒剂或灭菌工艺对细菌芽孢的杀灭能力。其制备过程包括菌种复苏、传代培养、扩大培养、芽孢形成率检查、芽孢收集、分散、自溶、过滤、离心清洗、热处理和冷藏保存等步骤。

合格的芽孢悬液应具有较高芽孢形成率、良好分散性、稳定活菌数和明确菌株来源。使用前必须进行活菌计数，怀疑污染时应进行形态学和生化鉴定。对于消毒试验而言，芽孢悬液不是普通菌液，而是影响结果准确性和可比性的关键试验材料，必须严格制备和质量控制。