副溶血性弧菌的检验：样品制备、分离鉴定与结果判读要点

副溶血性弧菌，学名 Vibrio parahaemolyticus，是一种常见的食源性致病菌，主要存在于海水、海产品及相关加工环境中。该菌为革兰氏阴性、无芽孢、兼性厌氧的嗜盐性弧菌，常污染鱼、虾、蟹、贝类等水产品，也可通过刀具、砧板、容器、人员手部等造成交叉污染。食用未充分加热的海产品，或食用被生海产品交叉污染的即食食品，是引发副溶血性弧菌食物中毒的重要原因。

在食品微生物检验中，副溶血性弧菌的检测通常包括样品制备、选择性增菌、分离培养、初步鉴定、生化确认和必要的血清学或分子生物学分析。检测结果不能仅凭菌落颜色或单项生化反应判断，而应结合嗜盐性、氧化酶、三糖铁反应、动力、生化特征等进行综合判定。

一、样品制备：水产品应注意取样代表性

副溶血性弧菌检验应尽量及时进行。样品放置时间过长、温度控制不当，可能导致菌量变化，影响检出结果。对于冷藏、冷冻或即食水产品，应按标准要求保存和运输，避免反复冻融和二次污染。

不同水产品的取样部位应有所区别。鱼类和头足类动物可取表面组织、肠或鳃；贝类应取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类可取整个动物，或取中心部位，包括肠和鳃。带壳贝类或甲壳类样品在开壳前，应先用自来水冲洗外壳，去除表面泥沙和杂质，甩干或擦干表面水分后，再以无菌操作打开外壳，避免外壳污染物带入检样。

一般取样量为25 g或25 mL，加入225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中，充分匀质。原文中“加入225 mL后再放入500 mL容器并再加225 mL”的表述容易造成误解，实际操作应按标准规定的样品量和稀释比例执行，不能重复加液导致稀释比例错误。匀质后应置于适宜容器中培养，容器容量应足够，防止培养过程中溢出或污染。

二、选择性增菌：3%氯化钠碱性蛋白胨水的作用

副溶血性弧菌具有嗜盐性，且在弱碱性环境中恢复和增殖较好。因此，3%氯化钠碱性蛋白胨水是常用的选择性增菌培养基。其主要作用是为弧菌提供适宜盐浓度和营养条件，同时通过碱性环境抑制部分非目标菌。

增菌培养通常在36 ℃±1 ℃条件下进行，时间应按现行标准要求控制。增菌时间过短可能导致目标菌数量不足，降低检出率；增菌时间过长则可能使背景菌过度生长，影响后续分离。增菌液培养后应及时进行选择性分离。

三、分离培养：TCBS和弧菌显色培养基的应用

增菌后，可将增菌液划线接种于选择性平板，如TCBS琼脂或弧菌显色培养基。TCBS琼脂是弧菌分离中常用的选择性鉴别培养基，其中胆盐、柠檬酸盐和碱性环境可抑制部分杂菌，硫代硫酸盐、柠檬酸铁和蔗糖指示系统可辅助区分不同弧菌。

副溶血性弧菌通常不发酵蔗糖，因此在TCBS琼脂上多形成绿色或蓝绿色菌落。需要注意，创伤弧菌、拟态弧菌等部分弧菌也可能出现类似菌落，霍乱弧菌等发酵蔗糖的弧菌则常呈黄色菌落。因此，TCBS上的菌落颜色只能作为初筛依据，不能直接作为最终鉴定结果。

弧菌显色培养基可提高可疑菌落识别效率，但不同产品的显色底物和判读颜色可能不同，应按厂家说明书和标准要求操作。无论使用哪类选择性平板，均应挑取典型和可疑菌落进行纯化和后续鉴定。

四、初步鉴定：形态、氧化酶和三糖铁反应

从选择性平板上挑取可疑菌落后，应进行纯化培养，再开展初步鉴定。副溶血性弧菌革兰氏染色为阴性，菌体可呈弧状、杆状、卵圆状，两端有时浓染，无芽孢，具有鞭毛并有动力。

氧化酶试验通常为阳性。原文中“VP为氧化酶阳性”的写法不准确，VP是副溶血性弧菌英文名 Vibrio parahaemolyticus 的缩写之一，而不是“V-P试验”。应表述为“副溶血性弧菌氧化酶阳性”。

在3%或3.5%氯化钠三糖铁琼脂上，副溶血性弧菌通常表现为斜面不产酸或保持碱性、底层产酸，硫化氢阴性，一般不产气或产气不明显。若出现明显硫化氢阳性、强产气或与典型反应明显不符，应进一步复核菌株纯度和鉴定结果。

五、嗜盐性试验：副溶血性弧菌的重要特征

嗜盐性是副溶血性弧菌鉴定的重要依据。该菌通常在不含氯化钠的培养基中不生长或生长很弱，在含6%和8%氯化钠的胰胨水中生长良好，在10%氯化钠中不生长或仅微弱生长。原文中“7%旺盛生长、10%不生长”的表述可以作为旧资料参考，但实际检测应按标准设置0%、6%、8%、10%氯化钠等条件进行观察，更利于与标准判定保持一致。

嗜盐性试验判读时，应与阴性对照和阳性对照比较，观察培养液浑浊程度。若浑浊不明显，应避免主观判断，可结合再培养或其他确认试验综合判定。

六、生化确认试验：不能依赖单项结果

副溶血性弧菌的生化确认通常包括ONPG试验、甘露醇试验、赖氨酸脱羧酶试验、MR-VP试验等，也可使用经验证的生化鉴定试剂盒或自动微生物鉴定系统。

典型副溶血性弧菌一般表现为：氧化酶阳性、动力阳性、葡萄糖阳性、蔗糖阴性、乳糖阴性、硫化氢阴性、甘露醇阳性、赖氨酸脱羧酶阳性、VP阴性、ONPG阴性。具体判定应以现行标准和试剂说明为准。对于结果不典型的菌株，应重新纯化培养，必要时结合分子检测或质谱鉴定。

常见鉴定项目及意义如下：

七、血清学和分子检测：用于流行病学和致病性分析

副溶血性弧菌有多个O抗原和K抗原血清型，部分血清型与食物中毒事件关系密切。血清学分型可用于污染溯源、流行病学调查和食物中毒分析，但血清型本身并不能完全代表致病性。

从致病机制看，副溶血性弧菌的重要毒力因子包括耐热直接溶血毒素TDH及相关溶血毒素TRH，其编码基因常用tdh、trh表示。在食品安全风险分析或食物中毒调查中，可根据需要进一步检测毒力基因，以判断菌株潜在致病性。常规食品检验是否进行毒力基因检测，应以具体标准、监管要求和实验室能力为准。

八、检验流程概览

九、常见误区与注意事项

第一，不能把TCBS上的绿色菌落直接判定为副溶血性弧菌。绿色菌落只提示不发酵蔗糖的可疑弧菌，还需通过氧化酶、嗜盐性、生化反应等确认。

第二，不能忽略样品类型差异。贝类、甲壳类、鱼类的污染部位不同，取样不当可能造成漏检。带壳样品开壳前应先清洗外壳，防止外表污染进入检样。

第三，不能使用普通蛋白胨水替代3%氯化钠碱性蛋白胨水。副溶血性弧菌为嗜盐菌，盐浓度和pH会影响复苏与增殖。

第四，不能只根据“是否嗜盐”作最终判断。嗜盐性是重要特征，但其他弧菌也可能具备一定嗜盐性，必须结合完整生化结果。

第五，不能忽视交叉污染。副溶血性弧菌可通过生熟不分的刀具、砧板和容器污染熟食或即食食品。实验室操作中也应防止阳性菌株、增菌液和样品之间交叉污染。

十、培养基质量控制要点

副溶血性弧菌检验涉及3%氯化钠碱性蛋白胨水、TCBS琼脂、弧菌显色培养基、含盐TSI、含盐生化培养基等多种培养基。培养基性能会直接影响检出率和结果判定。

3%氯化钠碱性蛋白胨水应关注pH、盐浓度和促生长能力；TCBS琼脂应关注选择性、蔗糖鉴别能力和菌落颜色；含盐TSI和生化培养基应关注氯化钠浓度、指示剂颜色和反应灵敏度。新批号培养基或自配培养基应按相关标准进行质量控制，必要时使用标准菌株验证促生长、选择性和鉴别能力。

结语

副溶血性弧菌检验的关键在于“规范取样、选择性增菌、有效分离、综合鉴定”。该菌具有明显嗜盐性，常与海产品及交叉污染食品相关，但仅凭菌落颜色、嗜盐性或单项生化反应都不足以作出最终判断。实验室应严格按照现行标准开展样品制备、增菌、分离和确认试验，并结合培养基质量控制和必要的毒力分析，提高检出结果的准确性和可追溯性。对于水产品加工和餐饮环节而言，控制副溶血性弧菌风险的核心还包括低温储运、充分加热、生熟分开和防止交叉污染。