食品中沙门氏菌检验的操作要点与常见问题解析

沙门氏菌是食品微生物检验中最重要的食源性致病菌之一，广泛存在于人和动物肠道中，可通过畜禽屠宰、蛋品污染、食品加工交叉污染、储运温度控制不当以及厨房操作不规范等途径进入食品。肉与肉制品、蛋与蛋制品、乳制品、水产制品、即食食品和调理食品等，都是沙门氏菌风险监测中常见的关注对象。

GB 4789.4《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》是我国食品中沙门氏菌检测的重要方法标准。需要注意的是，GB 4789.4—2016 已被 GB 4789.4—2024 代替，因此实验室在正式检测、报告出具和质量体系文件更新时，应以现行版本为准。本文主要结合旧版标准使用中积累的操作经验，对沙门氏菌检验的关键控制点和常见疑问进行整理，供培养基使用和实验室操作参考。

一、认识沙门氏菌

沙门氏菌属于肠杆菌科，多数为革兰氏阴性、无芽孢杆菌，典型菌株具有周生鞭毛，能够运动。大多数沙门氏菌可分解葡萄糖并产酸，部分产气；多数不发酵乳糖；多数可产生硫化氢，因此在三糖铁琼脂、亚硫酸铋琼脂等培养基上常表现出与硫化氢相关的黑色反应。

从分类学上看，沙门氏菌属主要包括两个种：肠道沙门氏菌（Salmonella enterica） 和 邦戈尔沙门氏菌（Salmonella bongori）。其中与人类食源性感染关系最密切的是肠道沙门氏菌。沙门氏菌血清型众多，目前已知血清型超过 2500 种，食品检验中常见的血清型包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、婴儿沙门氏菌等。

由于食品样品中沙门氏菌数量可能很低，且常伴随大量背景菌或受损菌，因此标准检验方法通常采用“预增菌—选择性增菌—选择性分离—生化鉴定—血清学或分子确认”的流程。每一步都直接影响最终检出率。

二、预增菌：让受损沙门氏菌恢复活性

预增菌的主要目的是帮助样品中可能存在的受损沙门氏菌恢复活性，并初步增加目标菌数量。食品加工中的加热、干燥、冷冻、酸化、高盐和防腐剂等因素，都可能使沙门氏菌处于亚致死损伤状态。若直接进入选择性增菌或选择性平板，受损菌可能被抑制，导致漏检。

使用均质袋进行预增菌培养时，应选择质量可靠、密封性良好的均质袋。对于液体量较大或培养后容易膨胀的样品，建议使用带支撑结构或适合培养操作的均质袋夹具，避免培养过程中预增菌液渗漏，污染培养箱或造成样品交叉污染。

对于肉类、调理食品等颗粒较大的样品，建议使用带滤网均质袋。这样在均质后更容易用吸管吸取均匀的样品液，减少肉屑、脂肪颗粒或大颗粒物堵塞吸头、影响移液准确性的问题。

三、选择性增菌与平板分离的关键点

沙门氏菌检验中，选择性增菌用于抑制背景菌并促进沙门氏菌增殖。后续再转接至选择性分离平板，观察典型或可疑菌落。常用选择性分离培养基包括 XLD 琼脂、HE 琼脂、BS 琼脂、显色培养基等，不同平板的选择性和菌落表现各有特点。

如果选择性分离平板在培养 22～24 h 后未见典型沙门氏菌可疑菌落，不应立即判定阴性。部分沙门氏菌生长较慢，或在选择性平板上表现不典型，可继续培养 22～24 h 后再观察。若仍未出现典型菌落，也应根据标准要求挑取非典型可疑菌落进行后续鉴定。

平板在培养箱中堆叠时不宜过高。原文经验中提示为防止中间平皿过热，高度不宜超过 6 个平皿。平皿堆叠过高会影响热量和空气流通，使中间平板温度偏高或冷凝水增多，可能影响菌落大小、颜色和选择性表现。

对于 BS 平板，应注意避光保存并按规定时间使用。亚硫酸铋琼脂对光照和保存时间较敏感，平板放置过久可能导致选择性、颜色背景或硫化氢反应异常。因此，BS 平板宜新鲜制备、避光保存，并尽量在规定时间内使用。

四、三糖铁琼脂试验的注意事项

三糖铁琼脂试验是沙门氏菌生化鉴定中的经典项目，可用于观察葡萄糖、乳糖、蔗糖利用情况，产气情况以及硫化氢产生情况。沙门氏菌多数表现为斜面碱性、底层酸性，可产气，并常产生硫化氢。

进行 TSI 培养时，试管口不应拧得过紧，应保持适当通气。若试管口完全密闭，管内氧气不足，可能影响斜面反应，并可能导致硫化氢表现异常。另一方面，TSI 底层需要相对厌氧环境来体现糖分解反应，因此穿刺深度和琼脂柱高度也很重要。

原文提到，三糖铁琼脂底部糖分解需要厌氧环境，琼脂底层与斜面最低点之间的距离应不少于 4 cm。这一要求有助于保证底层有足够的厌氧反应区域，避免琼脂层过薄导致结果不典型。TSI 制备和接种时，应保证斜面、底层比例合适，并采用“穿刺底层 + 划线斜面”的规范接种方式。

五、移液与污染控制

沙门氏菌检测涉及预增菌液、选择性增菌液和平板转接，样品中可能含有较高浓度背景菌或目标菌，因此移液过程要特别注意防止交叉污染。

在移液时，可使用带一次性吸管的电动移液器。若液体不慎进入电动移液器，应立即更换滤芯，并按实验室污染处理程序进行清洁消毒，防止后续样品发生交叉污染。对于含颗粒样品，移液时应避免吸入固体碎屑，以免影响体积准确性或造成仪器污染。

微量移液器吸头较短，在处理增菌液、均质液或高污染风险样品时，容易造成枪体污染。原文建议在该类移液过程中不宜使用普通微量移液器。实际工作中，可根据实验室 SOP 选择加长滤芯吸头、一次性无菌吸管或电动移液器，并严格执行污染控制要求。

六、沙门氏菌常见问题解析

问题一：所有沙门氏菌都有致病力吗？
从公共卫生角度看，沙门氏菌属中与人和动物感染相关的菌株较多，许多血清型具有致病潜力。但不同血清型、不同宿主适应性和不同菌株的致病能力并不完全相同。食品检验中通常将检出的沙门氏菌作为重要食源性致病菌风险处理，不应因血清型不同而忽视其食品安全意义。

问题二：所有沙门氏菌都能产生硫化氢吗？
不是。绝大多数沙门氏菌硫化氢阳性，但存在例外。例如部分伤寒、副伤寒相关沙门氏菌或个别特殊血清型可能硫化氢阴性或弱阳性。因此，不能仅凭硫化氢阴性就排除沙门氏菌，仍需结合选择性平板、生化反应和血清学或分子方法综合判断。

问题三：为什么没有典型菌落时仍要挑取非典型菌落？
因为部分沙门氏菌在选择性分离平板上的表现并不典型。受样品基质、菌株差异、受损状态、培养基批次和培养时间影响，沙门氏菌可能出现菌落较小、颜色偏浅、黑心不明显或其他非典型形态。如果只挑取“教科书式典型菌落”，可能造成漏检。因此，标准流程通常要求挑取多个典型或可疑菌落进行确认。

问题四：所有沙门氏菌都有动力吗？
多数沙门氏菌具有周生鞭毛并有动力，但也存在少数无动力或动力弱的菌株。因此，半固体动力试验阴性不能单独排除沙门氏菌，应结合其他生化和血清学结果判断。

问题五：从哪里获取沙门氏菌血清分型资料？
沙门氏菌血清分型通常依据 Kauffmann-White-Le Minor 血清分型方案。历史上，WHO 与法国巴斯德研究所发布的相关分型资料是重要参考来源。由于血清型资料会持续更新，实验室应使用现行有效的权威资料、标准文件或经认可的血清学试剂说明书进行判读。

问题六：80% 甘油-BHI 肉汤菌种冻存液如何配制和使用？
常见做法是将 BHI 肉汤干粉按说明书用约一半体积的水充分溶解，再加入等体积甘油，使甘油终浓度约为 50%，混匀后分装于菌种冻存管中，经 121℃高压灭菌 15 min 后备用。使用时，将鉴定确认的沙门氏菌从非选择性平板上刮取适量菌苔，加入甘油-BHI 冻存液中混匀，标识菌名、编号、日期和代次后，置 -80℃长期保存。需要注意的是，不同实验室可根据自身 SOP 使用 15%～50% 不同甘油终浓度的冻存体系，关键是经过验证并能保证复苏效果。

问题七：预增菌或选择性增菌后肉汤不浑浊，可以终止实验吗？
不可以。肉眼可见浑浊通常需要较高菌浓度，而样品中的目标菌可能数量低、增长慢，或在选择性增菌液中背景不明显。即使肉汤外观无明显浑浊，也不能说明没有沙门氏菌。应按照标准流程继续转接选择性平板，不能仅凭肉眼观察终止实验。

七、培养基质量对沙门氏菌检出的影响

沙门氏菌检验高度依赖培养基性能。预增菌培养基应能帮助受损菌恢复；选择性增菌培养基应在抑制背景菌的同时促进沙门氏菌增殖；选择性分离平板应能使目标菌表现出可识别的典型或可疑菌落；生化培养基应能准确反映糖分解、产气、硫化氢、赖氨酸脱羧酶等关键反应。

培养基质量异常可能造成漏检或误判。例如，选择性过强会抑制受损沙门氏菌，选择性不足会导致杂菌覆盖目标菌；指示剂或 pH 异常会使菌落颜色不典型；TSI 琼脂高度不合适会影响底层酸化和硫化氢结果；BS 平板保存过久会影响黑色反应和背景色。因此，培养基使用前应进行外观检查、有效期确认和必要的质控菌株验证。

八、小结

沙门氏菌是食品安全监测中的重点食源性致病菌。食品中沙门氏菌检验不仅依赖标准流程，也依赖细节控制，包括样品均质、预增菌、选择性增菌、选择性平板挑菌、生化鉴定、污染控制和培养基质量。

GB 4789.4—2016 的许多操作经验仍具有参考价值，但现行正式检测应以 GB 4789.4—2024 为准。实验室在执行沙门氏菌检验时，应及时更新标准文件和 SOP，严格控制培养基质量、培养条件和污染风险。对于无典型菌落、硫化氢阴性、动力弱或增菌液不浑浊等情况，不能简单排除沙门氏菌，而应按标准要求进行后续确认，才能保证检验结果准确可靠。