细菌的镜检：制片、染色与结果观察

细菌个体微小，多数无色透明，直接用普通光学显微镜观察时对比度较低。因此，细菌镜检通常需要经过制片、固定、染色和油镜观察等步骤。通过镜检，可以初步了解细菌的形态、大小、排列方式、革兰氏染色反应，以及是否具有芽胞、荚膜、鞭毛和运动性等特征。

细菌镜检是微生物检验中的基础技术，但它不能单独完成菌种鉴定。实际判定时，应结合菌落形态、培养特征、生化反应、质谱鉴定或分子检测结果综合分析。

一、细菌镜检观察什么

细菌镜检常观察以下内容：

镜检前，载玻片和盖玻片必须洁净、无油污、无划痕。玻片不洁会造成染色背景脏、菌体附着差、镜下杂质多，影响结果判断。

二、常用制片方法

细菌制片方法主要包括湿片法、悬滴法和涂片法。不同方法适用于不同观察目的。

1. 湿片法

湿片法又称压片法，适合观察活菌形态、运动状态和芽胞位置等。操作时，将一滴无菌水、生理盐水或培养液滴于洁净载玻片上，取少量待检材料混匀，再轻轻加盖盖玻片，避免产生气泡。

若供检材料本身为液体且浓度适中，可直接取一滴样品制片，不必另加水。观察活菌运动时，不宜随意加入美蓝、复红等染料，因为染料可能影响细菌活性，造成运动性判断失真。若只是为了提高形态观察对比度，可采用低浓度活体染色或普通染色，但应明确这不再等同于完全自然状态下的运动观察。

湿片法的优点是快速、简便，可观察活菌状态；缺点是对比度较低，样品容易干燥，也不适合长期保存。

2. 悬滴法

悬滴法适用于观察活细菌的运动、繁殖过程、芽胞萌发或短时间动态变化。其特点是液滴悬挂在凹玻片的凹窝中，不易被盖玻片压扁，细菌活动空间较大。

制片时，在盖玻片中央加一小滴菌悬液，将凹玻片凹窝边缘涂少量凡士林，再把凹玻片倒扣在盖玻片上，使液滴位于凹窝中央。随后翻转玻片，使液滴悬垂在凹窝内进行观察。

未染色活菌透明度高，观察时可适当降低聚光器、缩小光圈或使用相差显微镜，以增强对比度。若需要观察较长时间，应保持湿度和适宜温度，防止液滴蒸发导致细菌失活。

3. 涂片法

涂片法主要用于染色观察。其基本方法是在载玻片中央加一小滴无菌水或生理盐水，取少量菌体混匀，涂成薄而均匀的菌膜，自然干燥后固定，再进行染色。

涂片应薄而均匀，不宜过厚。涂片太厚会造成染色不均、脱色困难、菌体重叠，尤其会影响革兰氏染色结果。来自液体培养物的样品，可直接取少量培养液涂片；来自固体培养基的菌落，只需挑取极少量菌体。

三、固定的目的和注意事项

涂片干燥后通常需要固定。固定的目的包括：杀死微生物，使菌体牢固附着在载玻片上，保持基本形态，并提高细胞对染料的亲和性。

常用固定方法包括火焰固定和甲醇固定。火焰固定时，应让载玻片涂片面向上，快速通过火焰数次即可，不能长时间烘烤。过度加热会导致菌体皱缩、变形、破裂，甚至影响染色反应。旧资料中“以手摸载片发烫为宜”的说法不够规范，也不安全，现代实验室应按SOP控制固定方式。

甲醇固定较温和，常用于某些形态保持要求较高的涂片。无论哪种固定方式，都应在涂片完全自然干燥后进行，否则菌膜容易被热气冲散或形成气溶胶风险。

四、单染色法

单染色法又称简单染色法，只使用一种染料，主要用于观察细菌的基本形态、大小和排列方式。常用染料包括吕氏美蓝、碱性复红、结晶紫等。

单染色基本流程为：制备薄涂片，自然干燥，固定，加染液作用一定时间，水洗，吸干或晾干后镜检。单染色操作简单、结果直观，但不能区分革兰氏阳性和阴性，也不能清楚显示复杂结构。

单染色适合观察纯培养物是否形态一致。例如污染菌初筛时，可通过单染色快速判断样品中是否存在多种形态的微生物；菌种纯化时，也可辅助判断培养物是否混杂。

五、革兰氏染色法

革兰氏染色是最常用的鉴别染色方法。其结果可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色或粉红色。

革兰氏染色的基本步骤如下：

原文中的“路氏碘液”应修正为“卢戈氏碘液”。复染液可用番红、沙黄或碱性复红，具体按实验室SOP执行。石炭酸复红更常见于抗酸染色等特殊染色，不宜作为革兰氏染色的唯一推荐复染液。

六、革兰氏染色的关键控制点

革兰氏染色成败主要取决于涂片厚度、菌龄、脱色时间和染液质量。

涂片过厚会导致脱色不足，使革兰氏阴性菌误判为阳性。脱色过度则会使革兰氏阳性菌失去紫色，误判为阴性。脱色步骤应根据脱色剂种类、涂片厚度和实验室经验控制，不能机械延长或缩短。

菌龄也会影响结果。许多细菌宜选择18～24 h新鲜培养物进行革兰氏染色。老龄革兰氏阳性菌因细胞壁受损，可能出现染色不均或假阴性。原文中“24～48 h培养物”并非所有细菌都适用，应按目标菌和培养条件选择新鲜、典型培养物。

此外，染液老化、碘液失效、水洗过猛、固定过度、培养基残留过多等都会影响结果。镜检时应同时观察细胞形态和排列方式，避免只看颜色下结论。

七、芽胞染色法

芽胞是某些细菌在不良环境下形成的休眠结构，常见于芽胞杆菌属和梭菌属。芽胞壁厚、通透性低，普通染色不易着色，因此需要特殊芽胞染色法。

常用芽胞染色法包括孔雀绿-番红法和石炭酸品红法。孔雀绿-番红法中，孔雀绿在加热条件下进入芽胞，水洗后芽胞保留绿色；菌体再经番红复染后呈红色。因此镜下可见芽胞绿色、营养细胞红色。

芽胞染色基本流程为：取能形成芽胞的培养物制成涂片，干燥固定；滴加孔雀绿染液，加热至冒蒸汽但不沸腾，维持数分钟，期间保持染液不干；冷却后水洗；用番红复染；水洗、干燥后油镜观察。

需要注意，芽胞形成与菌种、培养基和培养时间有关。许多芽胞形成菌在24 h培养时芽胞未必充分形成，必要时应选用较老培养物或适合产芽胞的培养条件。镜检时应观察芽胞位置，如中央、近端或末端，以及是否使菌体膨大。

八、荚膜染色法

荚膜是部分细菌细胞壁外的黏性结构，多由多糖或多肽组成。荚膜不易被普通染料直接染色，常采用负染色或特殊荚膜染色法观察。常用背景染料包括墨汁、印度墨汁或尼格罗辛等，菌体可用复染液着色，荚膜则呈现为菌体外周的透明 halo 区。

荚膜染色常用于肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌等荚膜较明显菌的形态观察。由于荚膜容易因过度加热、水洗或机械涂抹而受损，制片时应尽量轻柔，通常不宜强烈火焰固定。

荚膜染色结果具有一定主观性，应结合菌落黏稠性、拉丝现象、生化鉴定或分子方法综合判断，不能只凭一次荚膜染色确定菌种。

九、鞭毛染色与运动性观察

鞭毛是部分细菌的运动器官，直径很细，普通光学显微镜下不易直接观察。鞭毛染色通常通过媒染剂使鞭毛表面沉积染料或金属盐，使其加粗后可见。该方法对操作要求较高，受菌龄、培养条件、涂片手法和染色液质量影响很大。

实际检验中，判断细菌运动性常用悬滴法、湿片法或半固体培养基穿刺法。悬滴法可直接观察活菌运动，但要区分真正运动和布朗运动。真正运动表现为细菌有方向性位移；布朗运动则是原地颤动，没有持续方向性。

半固体培养基穿刺法更适合常规判断运动性。运动性细菌会从穿刺线向周围扩散生长，无动力菌通常仅沿穿刺线生长。

十、油镜观察要点

细菌个体小，染色标本通常使用100×油镜观察。使用油镜前，应先用低倍镜找到涂片区域，再用高倍镜选择合适视野，最后滴加香柏油或专用镜油，转入油镜观察。

油镜观察时应调节聚光器和光圈，使视野清晰。观察结束后，应及时用擦镜纸和专用清洁液清除镜头上的镜油，避免油污影响镜头。载玻片上的镜油也应妥善清理，染色玻片和污染材料按实验室规定处理。

十一、常见镜检问题与原因

十二、小结

细菌镜检是微生物实验室的基础技术，可用于观察细菌形态、排列、革兰氏染色反应、芽胞、荚膜、鞭毛和运动性。湿片法和悬滴法适合观察活菌状态，涂片法适合染色观察；单染色用于基本形态观察，革兰氏染色用于初步分类，芽胞染色用于判断芽胞形成情况。

镜检结果的可靠性取决于玻片洁净度、涂片厚度、菌龄、固定方式、染色步骤、脱色时间和显微镜操作。镜检可以快速提供方向性信息，但不能代替系统鉴定。规范的镜检应与培养特征、生化反应、质谱或分子检测结果结合，才能形成更准确的微生物学判断。