纸片扩散法（K-B法）药敏试验：原理、操作与结果判读要点

纸片扩散法又称Kirby-Bauer法，简称K-B法，是抗菌药物敏感性试验中应用广泛的经典方法。它通过观察抗菌药物纸片周围形成的抑菌圈大小，判断待检菌对相应抗菌药物的敏感程度。由于操作相对简便、成本较低、结果直观，K-B法常用于临床微生物、教学实验、耐药监测及抗菌药物筛选等场景。

需要注意的是，K-B法虽然操作形式简单，但它是一项高度标准化的试验。菌液浓度、培养基厚度、pH、药敏纸片效价、平板干湿程度、培养时间和判读标准都会影响结果。只有在规范条件下获得的抑菌圈直径，才能进一步按标准折点解释为敏感（S）、中介或增加暴露时敏感（I）、耐药（R）等类别。

一、K-B法的基本原理

K-B法是将含有定量抗菌药物的纸片贴放在已经接种待检菌的琼脂平板表面。纸片中的药物吸收琼脂中的水分后溶解，并不断向周围扩散，在纸片周围形成由高到低递减的药物浓度梯度。

在药物浓度达到或超过抑制待检菌生长所需浓度的区域，细菌生长受到抑制，形成透明或相对清晰的抑菌圈。抑菌圈越大，通常说明该菌对该药物越敏感；抑菌圈越小或无抑菌圈，通常提示敏感性较低或耐药。一般情况下，抑菌圈直径与最低抑菌浓度MIC呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

但这种关系并不能简单外推到所有药物和菌种。不同抗菌药物的扩散速度、作用机制、纸片含量和临床折点不同，因此必须按“菌种—药物—标准版本”查表判读。

二、试验菌液的制备

K-B法要求使用纯培养菌落。通常从琼脂平板上挑取形态相似的新鲜纯培养菌落，接种于肉汤培养基中培养至适当浊度，再用无菌生理盐水或肉汤调节至0.5麦氏浊度。也可直接挑取菌落悬浮于无菌盐水或肉汤中，调至0.5麦氏浊度，这称为直接菌悬液法。

0.5麦氏浊度对应的菌量大约为1×10⁸ CFU/mL～2×10⁸ CFU/mL。菌液浓度是影响抑菌圈大小的关键因素：菌液过浓会使抑菌圈偏小，可能误判为耐药；菌液过稀会使抑菌圈偏大，可能误判为敏感。

对于生长较慢、苛养菌或特殊菌种，应按相应标准方法调整菌液制备方式，不能简单套用普通细菌流程。

三、M-H琼脂平板的接种方法

K-B法常用Mueller-Hinton琼脂，即M-H琼脂。接种时，用无菌棉拭子浸入调好的菌悬液中，在管壁挤去多余液体，然后在M-H琼脂平板表面均匀涂布。通常应沿一个方向涂布整个琼脂表面，再将平皿旋转约60°重复涂布，共涂布三次，最后沿琼脂边缘涂抹一圈，以保证形成均匀菌膜。

涂布完成后，将平板在室温放置约3 min～5 min，使表面多余水分被吸收。放置时间过短，平板表面过湿，纸片周围药物可能扩散异常；放置时间过长，菌体可能开始生长或表面过干，也会影响结果。

四、药敏纸片的贴放

用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片，贴于接种后的平板表面，并用镊尖轻压，使纸片与琼脂充分接触。纸片一旦贴放，不宜再移动，因为药物会很快开始扩散，移动纸片可能造成双重扩散影，影响抑菌圈形态和读数。

旧资料中提到每张纸片间距不小于24 mm，纸片中心距平板边缘不小于15 mm，90 mm平板适宜贴6张药敏纸片。实际操作中，纸片数量和距离应根据标准方法、药物扩散特性和抑菌圈大小合理安排，原则是避免抑菌圈重叠，保证每个抑菌圈可准确测量。

药敏纸片应按说明书要求保存，避免受潮、过期或反复室温暴露。纸片效价下降会导致抑菌圈偏小，造成误判。

五、培养条件

贴好纸片的平板应按所用标准和菌种要求进行培养。普通需氧菌K-B法常在约35 ℃条件下培养，培养时间多为18 h～24 h；但不同菌种、不同标准体系和不同药物可能对温度、时间和气体环境有特殊要求。

例如，部分苛养菌需要含二氧化碳环境或特殊培养基，厌氧菌不能按普通有氧K-B法处理。因此，培养条件不能只按“35 ℃过夜”笼统执行，应结合菌种和标准方法确定。

六、抑菌圈测量

培养结束后，用游标卡尺、直尺或自动读数系统测量抑菌圈直径，单位通常为mm。测量时应包括纸片直径在内，读取完整抑菌圈的边缘。若菌膜均匀、边界清晰，读数较容易；若边界模糊、出现拖尾或圈内有少量菌落，应按所执行标准的规则判读。

旧资料中提到，某些细菌可能在某些抗生素抑菌圈内出现微量生长，如磺胺类药物抑菌圈内有少量薄雾状生长时，可按外圈判断。但这类情况必须依据标准或实验室SOP处理，不能随意忽略所有圈内生长。

七、结果判读：S、I、R不是凭经验判断

K-B法最终结果不是只报告抑菌圈直径，而是需要根据该菌种和该抗菌药物的解释折点，将结果判为敏感（S）、中介或增加暴露时敏感（I）、耐药（R）等类别。不同抗菌药物的抑菌圈标准不同，同一种药物对不同细菌的判断标准也可能不同。

因此，不能说“抑菌圈大于某个固定值就是敏感”。正确做法是查阅现行CLSI、EUCAST、FDA或国内相关标准，并注明所依据的版本。折点会随着耐药机制、临床证据和药代药效数据更新而修订，长期使用旧折点可能导致结果误判。

八、M-H琼脂培养基的质量要求

M-H琼脂是K-B法中最关键的培养基。合格的M-H琼脂应按商品干粉说明制备，高压灭菌后冷却至45 ℃～50 ℃左右倾注平皿，使琼脂表面水平、厚度均匀。常规要求琼脂厚度约4 mm，pH为7.2～7.4，表面应保持适度湿润但不得有水滴。

M-H琼脂质量不稳定是K-B法结果异常的重要原因之一。对于培养基生产和使用实验室，应对每批培养基进行无菌性、促生长能力和药敏质控验证。

九、常见误差与原因分析

十、质量控制是K-B法的核心

K-B法必须使用质控菌株进行质量控制。质控菌株的抑菌圈应落在规定范围内，才能说明培养基、药敏纸片、菌液制备、培养条件和读数过程基本受控。若质控结果超出范围，应查找原因，不能继续报告正式样品结果。

质量控制应覆盖培养基批号、药敏纸片批号、保存条件、培养箱温度、菌液浊度、平板厚度、pH和读数人员一致性。对于新批次M-H琼脂、新批次药敏纸片或新设备投入使用时，更应加强验证。

小结

纸片扩散法（K-B法）通过测量抗菌药物纸片周围的抑菌圈直径，评价细菌对药物的敏感性。其原理是药物在琼脂中扩散形成浓度梯度，细菌在有效抑菌浓度范围内不能生长，从而形成透明抑菌圈。抑菌圈直径通常与MIC呈负相关，但最终结果必须按现行折点解释为S、I、R等类别。

K-B法的可靠性取决于标准化操作：菌液应调至规定麦氏浊度，M-H琼脂厚度约4 mm且pH为7.2～7.4，纸片贴放间距合理，培养条件符合标准要求，抑菌圈测量准确，并使用质控菌株验证。对于培养基和药敏纸片供应企业而言，稳定的M-H琼脂质量、合格的纸片效价和完善的批次质控，是保障药敏结果准确可靠的基础。