致泻性大肠埃希氏菌的分离与鉴定要点

大肠埃希氏菌广泛存在于人和温血动物肠道中，多数菌株并不致病，但部分菌株获得毒力基因后，可引起腹泻、出血性肠炎，甚至溶血性尿毒综合征等严重疾病。这类能够引起腹泻为主症状的大肠埃希氏菌，统称为致泻大肠埃希氏菌，又称致泻性大肠埃希氏菌或 diarrheagenic Escherichia coli，简称 DEC。

食品微生物检验中，致泻大肠埃希氏菌的检测不能只依靠菌落形态或普通生化反应判断。因为普通大肠埃希氏菌与致泻菌株在麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂以及多数基础生化反应上非常相似，真正决定其致病性的，是特定毒力基因、毒素或黏附侵袭能力。因此，现代检测思路应是“增菌分离—生化确认大肠埃希氏菌—血清学辅助分型—PCR毒力基因确认”的综合流程。

一、致泻大肠埃希氏菌主要类型

常见致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌以及肠道集聚性大肠埃希氏菌。不同类型的致病机制不同，检测靶点也不同。

类型	英文简称	主要致病特点	主要检测关注点
肠道致病性大肠埃希氏菌	EPEC	黏附肠上皮细胞，引起附着-擦拭性损伤，多与婴幼儿腹泻有关	eae等黏附相关基因，典型EPEC还可关注bfpA
肠道侵袭性大肠埃希氏菌	EIEC	侵入肠上皮细胞，引起痢疾样腹泻，特征接近志贺氏菌	ipaH、invE等侵袭相关基因
产肠毒素大肠埃希氏菌	ETEC	产生热稳定或热不稳定肠毒素，引起水样腹泻	ST、LT相关毒素基因
产志贺毒素大肠埃希氏菌	STEC	产生志贺毒素，可引起出血性肠炎；部分菌株属于EHEC	stx1、stx2等志贺毒素基因
肠道出血性大肠埃希氏菌	EHEC	STEC中临床危害较重的一类，典型代表包括部分O157:H7/NM菌株	stx基因，常结合eae、血清型等信息判断
肠道集聚性大肠埃希氏菌	EAEC	呈集聚性黏附，常与持续性腹泻有关	aggR、aatA等集聚黏附相关基因

需要注意，血清型与致病型有关联，但不能完全等同。某些血清群中可能包含致泻菌株，也可能包含不携带相应毒力基因的普通大肠埃希氏菌。因此，血清学结果通常只能作为分型和筛查依据，最终确认应结合毒力基因检测和标准规定的判定规则。

二、样品增菌与选择性分离

食品样品中致泻大肠埃希氏菌数量可能较低，并受到食品基质、加工损伤、冷藏、干燥、盐分、酸度等因素影响，因此通常需要先进行增菌，使受损细胞恢复并提高检出率。增菌条件应按现行标准和样品类别执行，不能随意改变增菌温度、时间或培养基种类。

增菌后，可将增菌液划线接种于麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂平板，于36 ℃±1 ℃培养18～24 h。两类平板都可用于大肠埃希氏菌的选择性分离和初步鉴别，但选择性、菌落颜色和乳糖发酵表现会受菌株状态与培养基质量影响。

麦康凯琼脂上，大肠埃希氏菌通常表现为粉红色至红色、圆形、湿润、边缘整齐的菌落，部分菌株颜色可较浅。伊红美蓝琼脂上，典型大肠埃希氏菌常呈紫黑色或紫红色，部分菌落可有金属光泽。但并非所有致泻大肠埃希氏菌都表现典型，例如EIEC可出现乳糖迟缓发酵或不发酵，容易与志贺氏菌相似。因此，挑菌时不应只选择最典型菌落，也应适当挑取可疑菌落。

三、初步生化鉴定：先确认是否为大肠埃希氏菌

从选择性平板上挑取5～10个典型或可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、尿素琼脂和营养琼脂斜面等培养基，于36 ℃±1 ℃培养18～24 h。通常选择三糖铁表现为底层产酸、硫化氢阴性，尿素阴性的菌株，进一步进行生化鉴定和后续分型。

大肠埃希氏菌一般为革兰氏阴性短杆菌，氧化酶阴性，发酵葡萄糖，多数发酵乳糖，靛基质阳性，甲基红阳性，V-P阴性，柠檬酸盐利用阴性。常规可概括为IMViC反应“++--”。但不同致泻型之间会有例外，尤其EIEC常表现为无动力或动力弱、赖氨酸脱羧酶阴性、不发酵或迟缓发酵乳糖，容易与志贺氏菌混淆。

因此，初步生化鉴定的目的不是直接判断“致泻性”，而是确认分离菌是否属于大肠埃希氏菌或可疑大肠埃希氏菌，再进入血清学和分子生物学确认步骤。

四、血清学鉴定：用于辅助筛查和分型

血清学试验主要针对O抗原和必要时的H抗原进行凝集反应。操作时通常挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的纯培养物，先用相应多价O血清进行玻片凝集试验；若与某一多价O血清出现凝集，再用该多价血清所包含的单价O血清进一步确认。若与某一单价O血清呈强凝集反应，可判为相应O群的假定阳性。

证实试验一般需制备O抗原悬液，并与稀释后的O血清进行试管凝集反应。经过规定温度和时间作用后观察凝集结果，出现明确凝集时，可证实相应O抗原。血清学操作应设置阴性对照，避免将自凝菌株误判为阳性。若菌悬液自身发生明显凝集，应先排除自凝干扰。

血清学鉴定的意义在于帮助判断菌株是否属于常见致泻大肠埃希氏菌相关血清群，但它不能替代毒力基因检测。因为同一O血清群内的菌株毒力差异可能很大，血清型阳性并不一定代表具有致泻能力；反之，某些携带毒力基因的菌株也可能不属于传统常见血清群。

五、PCR确认：现代判定的关键步骤

致泻大肠埃希氏菌的核心特征是携带特定毒力基因。因此，在完成分离、生化鉴定和必要的血清学筛查后，应进行PCR确认试验。PCR检测可针对不同致泻型的关键毒力基因进行扩增，判断菌株所属类型。

常见检测靶点包括：EPEC相关的eae、bfpA；EIEC相关的ipaH、invE；ETEC相关的LT和ST毒素基因；STEC/EHEC相关的stx1、stx2以及eae；EAEC相关的aggR、aatA等。具体靶基因、引物、扩增体系和判定规则应按现行标准或经验证的试剂盒说明执行。

PCR确认时应特别注意实验室分区和污染控制。模板制备区、反应体系配制区、扩增区和产物分析区应有效分开；每批检测应设置阳性对照、阴性对照和空白对照；若采用电泳观察扩增产物，应防止扩增产物气溶胶污染导致假阳性。

六、分离鉴定流程概览

步骤	主要操作	目的	注意事项
增菌	样品加入增菌培养基培养	促进受损菌恢复，提高检出率	按标准控制样品量、培养基、温度和时间
分离	增菌液划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂	获得单个可疑菌落	同时关注典型和可疑菌落
初筛	观察菌落颜色、形态和乳糖发酵表现	初步判断疑似大肠埃希氏菌	菌落形态不能作为最终依据
生化鉴定	TSI、尿素、氧化酶、IMViC等	确认是否为大肠埃希氏菌	注意EIEC与志贺氏菌相似
血清学试验	O抗原、必要时H抗原凝集	辅助筛查和分型	防止自凝和交叉凝集误判
PCR确认	检测毒力基因	判断致泻型别	需严格控制污染并设置对照
综合判定	结合分离、生化、血清学和PCR结果	出具最终结果	不应仅凭血清学或菌落形态判定

七、常用培养基在检测中的作用

培养基或试剂	主要作用	典型结果或用途
增菌培养基	促进目标菌复苏和增殖	提高低水平污染样品的检出率
麦康凯琼脂	选择分离肠杆菌科细菌，鉴别乳糖发酵	大肠埃希氏菌多呈粉红至红色菌落
伊红美蓝琼脂	选择分离并鉴别大肠埃希氏菌	典型菌落可呈紫黑色或带金属光泽
三糖铁琼脂	观察糖发酵、产气、硫化氢	大肠埃希氏菌通常底层产酸、H₂S阴性
尿素琼脂	排除强尿素酶阳性菌	大肠埃希氏菌通常尿素阴性
营养琼脂斜面	保存纯培养物	供生化、血清学和PCR检测使用
O/H诊断血清	血清学分型	用于常见血清群筛查和确认
PCR相关试剂	毒力基因确认	判断EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC等型别

八、结果判读中的常见误区

第一，不能将“大肠埃希氏菌阳性”直接等同于“致泻大肠埃希氏菌阳性”。普通大肠埃希氏菌是常见指示菌，而致泻大肠埃希氏菌必须具备相应毒力特征。

第二，不能仅凭麦康凯或伊红美蓝平板菌落形态判定。菌落形态只能提示疑似菌株，不同培养基批次、培养时间和菌株状态都会影响颜色和光泽。

第三，不能只看血清学阳性。O抗原凝集提示菌株属于某一血清群，但是否具有致泻能力仍需结合毒力基因确认。

第四，不能忽视非典型菌落。部分EIEC等菌株可能不发酵乳糖或动力阴性，表现并不符合普通大肠埃希氏菌的典型形态，若只挑取典型乳糖阳性菌落，可能造成漏检。

第五，PCR阳性也要结合分离菌株判定。食品样品中可能存在死菌DNA或背景菌干扰，规范流程应尽量基于分离纯化后的可疑菌株进行确认，并结合阴性、阳性和空白对照判断结果可靠性。

九、质量控制要点

致泻大肠埃希氏菌检测涉及培养、生化、血清学和分子生物学多个环节，应建立完整质量控制体系。培养基应按GB 4789.28等相关要求进行质量控制，确认促生长能力、选择性和鉴别能力。诊断血清应在有效期内使用，并按说明书保存。PCR试剂应避免反复冻融，扩增体系和引物应经验证。

实验过程中应设置必要对照，包括培养基空白、阴性对照、阳性对照和PCR空白对照。阳性对照菌株应来源明确、传代可追溯，使用后及时灭菌处理。检测区域应防止交叉污染，尤其PCR产物分析区不得与样品处理区混用。

结语

致泻大肠埃希氏菌的检测难点在于：它与普通大肠埃希氏菌外观相似，但致病性取决于毒力基因和致病机制。因此，可靠的分离鉴定不能停留在“平板菌落像不像”或“血清是否凝集”，而应通过增菌分离、生化确认、血清学辅助和PCR毒力基因检测进行综合判定。对于食品微生物实验室而言，规范使用选择性培养基、合理挑取可疑菌落、准确完成生化鉴定，并严格控制PCR污染，是提高致泻大肠埃希氏菌检出率和结果可信度的关键。