霍乱弧菌检验标准操作程序解析：增菌分离、血清分型与毒力基因检测

霍乱弧菌，学名 Vibrio cholerae，是一类革兰氏阴性、氧化酶阳性的弧菌。它可存在于水体、水产品及受污染食品中，其中 O1 群和 O139 群与霍乱流行关系最为密切。食品中检出霍乱弧菌，尤其是 O1 群或 O139 群，并进一步携带霍乱毒素相关基因时，具有重要公共卫生意义。

本操作程序主要参考 SN/T 1022—2010《进出口食品中霍乱弧菌检验方法》和《霍乱防治手册》第六版，适用于食品中霍乱弧菌的检验。方法流程包括样品处理、碱性蛋白胨水增菌、选择性平板分离、初步鉴定、生化鉴定、血清学分型以及 ctxAB 毒力基因检测。其核心逻辑是：先通过碱性、高盐环境促进弧菌增殖，再用选择性平板分离可疑菌落，最后结合生化特征、血清凝集和毒力基因结果进行综合判断。

一、方法来源与适用范围

本程序适用于食品中霍乱弧菌的检验，尤其适合水产品、冷冻食品、腌渍食品、干制品及其他可能受到水源或交叉污染影响的食品样品。

霍乱弧菌并非所有菌株都具有相同公共卫生风险。常规检验首先确认是否为霍乱弧菌，再通过诊断血清判断是否属于 O1 群或 O139 群，必要时进一步检测 ctxAB 基因，以判断其是否携带霍乱毒素相关基因。因此，霍乱弧菌检验不能只依赖选择性平板上的黄色菌落或单个生化反应，而应按流程逐步确认。

二、主要设备与材料

除微生物实验室常规灭菌、培养和无菌操作设备外，本方法还需要恒温培养箱、恒温水浴箱、均质器或无菌乳钵、天平、无菌试管、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌培养皿、微生物生化鉴定系统及无菌手术剪、镊子等。

若开展 ctxAB 毒力基因检测，还需 PCR 仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器、PCR 反应管、DNA 提取试剂或煮沸裂解相关耗材。

三、培养基和试剂的作用

霍乱弧菌检验常用碱性蛋白胨水、TCBS 琼脂、4号琼脂、庆大霉素琼脂、营养琼脂、生化鉴定试剂、霍乱弧菌诊断血清以及 ctxAB 基因 PCR 相关试剂。

碱性蛋白胨水是霍乱弧菌检验的关键增菌液。霍乱弧菌在碱性环境中生长较快，而许多背景菌受到抑制，因此该增菌步骤可显著提高目标菌检出率。

四、样品处理：25 g 样品制备 1:10 增菌液

称取 25 g 样品，加入盛有 225 mL 碱性蛋白胨水 的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min；也可置于无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若无均质器，可将样品放入无菌乳钵中磨碎，再转入 500 mL 灭菌容器中，加入 225 mL 碱性蛋白胨水，充分振荡。

冷冻产品应在 45℃以下不超过15 min，或在 2℃～5℃不超过18 h 条件下解冻。解冻时间过长或反复冻融可能影响目标菌状态；温度过高则可能损伤细菌，影响检出。

样品制备应充分均匀，尤其是水产品、带壳样品、腌渍食品和干制品。若样品中微生物分布不均，未充分均质会降低检出概率。

五、一次增菌与二次增菌

一次增菌根据样品类型选择不同培养条件。深冻样品、干品、腌渍产品置 36℃±1℃培养6 h～8 h；新鲜样品置 41.5℃±1℃培养6 h～8 h。若无明显细菌生长现象，可继续培养，但总培养时间不应超过 20 h。

二次增菌时，同时吸取一次增菌的表层增菌液 0.2 mL，加入 10 mL 碱性蛋白胨水中，置 36℃±1℃培养6 h～8 h。

选择表层增菌液是因为霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中常较快增殖，并可集中于液面附近。二次增菌可进一步提高目标菌数量，降低背景菌影响，为后续选择性平板分离创造条件。

六、选择性平板分离

从所有显示生长的一次和二次增菌管中，用接种环沾取一环表层增菌液，分别划线接种于 TCBS 平板和 4号琼脂平板；也可使用科玛嘉弧菌显色培养基或庆大霉素琼脂作为替代或辅助平板。平板置 36℃±1℃培养18 h～24 h。

不同选择性平板上霍乱弧菌的典型菌落如下：

TCBS 上黄色菌落主要反映蔗糖发酵，但其他弧菌也可能呈黄色，因此不能仅凭 TCBS 黄色菌落报告霍乱弧菌阳性。4号琼脂和庆大霉素琼脂可提供辅助筛选信息，但同样需要后续确认。

七、纯培养与初步鉴定

每个平板上各挑取 5 个或以上可疑菌落；若可疑菌落少于 5 个，则全部挑取。将其接种于营养琼脂斜面或平板，置 36℃±1℃培养18 h～24 h，获得纯培养物。

初步鉴定包括氧化酶试验、粘丝试验、革兰氏染色镜检和三糖铁琼脂试验。

三糖铁琼脂试验中，霍乱弧菌通常表现为发酵葡萄糖和蔗糖产酸，底层和斜面变黄，不产硫化氢，不产气。若初步鉴定结果与霍乱弧菌不符，应谨慎排除或重新纯化复核。

八、确定鉴定：生化系统或商品化鉴定试剂

初步鉴定结果相符者，应使用微生物生化鉴定系统或商品化生化鉴定试剂进行系统鉴定。霍乱弧菌主要生化性状包括：革兰氏阴性、无芽胞，氧化酶阳性，粘丝试验阳性，动力阳性，蔗糖阳性，葡萄糖阳性，分解葡萄糖不产气，乳糖可阴性或阳性，硫化氢阴性。

霍乱弧菌与拟态弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、河弧菌等在部分生化反应上存在重叠。因此，生化鉴定应结合选择性平板特征、氧化酶、粘丝试验、嗜盐性和血清学结果综合判断。

九、血清鉴定与 O1 群分型

自营养琼脂斜面上挑取纯培养物，与 O1 群及 O139 群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水作对照。诊断血清效价一般应为 1:40～1:50。若可疑菌落在血清中很快，通常 10 s 内出现肉眼可见明显凝集，而在生理盐水中不凝集，可判为阳性。

若 O1 群和 O139 群诊断血清均不凝集，方可报告未检出 O1 群及 O139 群霍乱弧菌。若确定为 O1 群霍乱弧菌，应进一步分别使用 小川型和 稻叶型单价血清进行玻片凝集，同时设置生理盐水对照。

血清凝集试验的关键是排除自凝。若菌体在生理盐水中也出现凝集，则说明存在自凝现象，不能直接根据血清凝集结果分型，应重新纯化或采用其他方法复核。

十、结果报告逻辑

当检出的可疑菌落生化学性状符合霍乱弧菌特征，同时与霍乱弧菌诊断血清凝集，且生理盐水对照不凝集时，可报告 25 g 或 25 mL 样品中检出霍乱弧菌。

对于风险监测或公共卫生相关样品，报告内容应符合监测方案或主管部门要求。若检出 O1 群或 O139 群，还应进一步进行毒力基因检测。

十一、ctxAB 毒力基因检测

若鉴定结果为霍乱弧菌，应进行 ctxAB 基因检测。ctxAB 编码霍乱毒素相关组分，是判断菌株毒力特征的重要分子指标。也可采用经过验证的商品化试剂盒。

DNA 模板可采用煮沸法制备：取适量纯培养菌落加入 500 μL 灭菌水中混匀，煮沸 10 min，以 15000×g 离心3 min，取上清液，-20℃保存备用。也可使用商品化 DNA 提取试剂盒按说明书制备模板。

PCR 可使用引物对：

5'-ATTTTGAGGTGTTCCATGTG-3'

5'-ATAAAGCAGTCAGGTGGTCT-3'

扩增产物大小为 749 bp。

PCR 反应体系可整理为 20 μL：灭菌水 12.8 μL，10×Buffer/MgCl₂ 2.0 μL，dNTPs 0.8 μL，混合引物 2.0 μL，模板 2.0 μL，Taq 酶 0.4 μL。反应程序为：94℃预变性 5 min；94℃ 30 s、56℃ 40 s、72℃ 2 min，30 个循环；72℃终延伸 7 min；随后 8℃保存。

电泳可使用 1.5%琼脂糖凝胶，加入 EB、GoldView 或其他核酸染料。取 5 μL PCR 产物点样，以 DNA 分子量标记物作参照，按实验室仪器条件进行电泳和成像分析。

在阴性对照无条带、阳性对照出现预期条带的前提下，若待测菌株出现 749 bp 扩增条带，可判定该菌株携带 ctxAB 基因；若未出现 749 bp 条带，则判定不携带 ctxAB 基因。若阴性对照出现条带或阳性对照无预期条带，本次结果无效，应重新试验并排查污染或扩增失败原因。

十二、常见问题与注意事项

第一，菌名应规范写作 Vibrio cholerae，中文为霍乱弧菌。英文名少写词尾 e 是常见错误。

第二，TCBS 黄色菌落只是可疑结果，不能直接报告霍乱弧菌阳性。蔗糖阳性的其他弧菌也可能形成黄色菌落。

第三，增菌液应取表层液接种。霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中常较快增殖，表层增菌液更适合后续分离。

第四，一次和二次增菌均应关注。对低水平污染样品，二次增菌可提高检出机会。

第五，血清凝集必须设置生理盐水对照。自凝菌株不能直接按血清阳性判定。

第六，O1 群阳性后需进一步用小川型和稻叶型血清分型。O139 群则按 O139 群报告。

第七，ctxAB 基因检测用于毒力特征判断。检出霍乱弧菌不等于一定携带 ctxAB，需通过 PCR 或经验证方法确认。

第八，PCR 操作应严格分区，设置阴性、阳性和空白对照，防止扩增产物污染造成假阳性。

第九，冷冻样品解冻应控制温度和时间。过热、长时间解冻或反复冻融都会影响细菌状态。

十三、小结

霍乱弧菌检验是一项兼具食品安全和公共卫生意义的微生物检测项目。该方法以碱性蛋白胨水增菌为基础，经 TCBS、4号琼脂、庆大霉素琼脂或显色培养基分离可疑菌落，再通过氧化酶、粘丝试验、革兰染色、三糖铁、生化鉴定和诊断血清凝集确认霍乱弧菌及其血清群。

对于已确认的霍乱弧菌，进一步检测 ctxAB 基因可判断其是否携带霍乱毒素相关基因。整个流程中，选择性平板只提供初筛线索，生化鉴定和血清学结果才是确认报告的关键；毒力基因检测则为风险评估提供重要补充。规范执行增菌、分离、鉴定、分型和 PCR 质控，是保证霍乱弧菌检验结果准确可靠的基础。