梭状芽孢杆菌检验标准操作程序解析：厌氧增菌、分离鉴定与肉毒梭菌确认

梭状芽孢杆菌是一类重要的厌氧或兼性厌氧产芽孢杆菌，广泛存在于土壤、沉积物、动物肠道、食品原料和加工环境中。该类细菌中既包括常见腐败菌，也包括与食品安全高度相关的菌种，例如产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、丁酸梭菌、生孢梭菌、艰难梭菌和巴氏梭菌等。其中，肉毒梭菌及其产生的肉毒毒素风险最高，检测时不仅要关注菌株分离，还要关注毒素基因或毒素本身。

本操作程序来源于食品及环境中产肉毒毒素梭状芽孢杆菌检测相关实验室流程，并参考 GB 4789.12—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验》。该方法适用于食品中梭状芽孢杆菌的定性检验，检测对象包括丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、艰难梭菌（Clostridioides difficile，旧称 Clostridium difficile）、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、巴氏梭菌（Clostridium baratii）等相关菌种。

一、方法特点：为什么梭菌检测强调厌氧？

梭状芽孢杆菌的共同特点是能形成芽孢，多数为严格厌氧菌。芽孢对热、干燥和不良环境具有较强耐受性，能在食品、土壤或环境样品中长期存活；一旦进入适宜的厌氧环境，芽孢可萌发成营养细胞并生长繁殖。

因此，梭菌检测的核心控制点有三个：第一，增菌培养基需要预先除氧；第二，接种和培养过程要尽量避免带入氧气；第三，分离培养期间必须保持稳定厌氧环境。若厌氧条件不足，目标菌可能不生长或生长缓慢，导致假阴性。

二、主要设备与材料

梭状芽孢杆菌检验除常规微生物设备外，还需要厌氧装置、生物安全柜、低温保存设备、PCR 或荧光 PCR 设备、离心机、显微镜和厌氧培养相关耗材。

由于可能涉及肉毒梭菌和肉毒毒素，实验室应具备相应生物安全条件。疑似肉毒梭菌或毒素阳性材料的操作，应严格按标准、风险评估和实验室安全制度执行。

三、培养基和试剂的作用

本方法涉及的培养基和试剂较多，可按增菌、分离、鉴定和保存四类理解。

庖肉培养基和 TPGYT 是梭菌增菌中的关键培养基。接种前需通过煮沸排除溶解氧，并快速冷却，避免培养基重新吸氧。

四、增菌培养：先除氧，再接种

接种前，先将 CMM 和 TPGYT 培养基置沸水中隔水煮沸 10 min～15 min，排除培养基中的溶解氧。煮沸后应迅速放入冰或冰水浴中快速冷却，尽量减少氧气重新溶入。

取混匀后的食品样品 25 g，置无菌均质袋内，加入 35 mL 明胶磷酸盐缓冲液，充分均质后，取 2 mL 样液分别接种 CMM 和 TPGYT 培养基，每种培养基接种 2 管。若为风干样品，应先加入明胶磷酸盐缓冲液，在室温浸泡 60 min 后再均质和接种。

这里的稀释原则与普通食品微生物计数不同。梭菌检验中，明胶磷酸盐缓冲液加入量以“足以均质并便于接种”为原则，体积不宜过大。过度稀释可能降低目标菌检出概率。

接种时应尽量靠近试管底部，避免产生气泡和剧烈搅动。必要时可用液体石蜡覆盖增菌液表面以加强厌氧环境；若厌氧装置密闭性良好，也可不加液体石蜡。

五、培养物检查：看浊度、产气、肉粒和气味

增菌培养 5 d 后，检查培养物的浊度、产气、肉粒消化情况和气味。若培养 5 d 后未见细菌生长，可继续培养至 10 d。

梭菌增菌液可能出现混浊、产气、肉粒消化、沉淀变化或特殊气味，这些现象可提示厌氧菌生长。但培养物外观只能作为筛查线索，不能直接作为结果报告依据。后续仍需分离纯化和鉴定。

六、分离培养：乙醇处理与哥伦比亚血琼脂

取 1 mL～2 mL 增菌液置 5 mL 灭菌离心管内，加入等量无水乙醇，充分混匀后室温静置 1 h。乙醇处理的目的是利用芽孢耐受性，降低非芽孢菌或营养细胞干扰，提高梭菌分离机会。

用接种环取经乙醇处理后的增菌液，接种至哥伦比亚血琼脂平板，置 35℃±1℃厌氧培养48 h～72 h。培养期间严禁破坏厌氧环境。

典型梭状芽孢杆菌在哥伦比亚血琼脂上多呈白色或半透明，菌落可扁平、粗糙，并可呈蔓延根状或轮状生长，部分菌落较难刮除。典型肉毒梭菌菌落多为扁平圆形、半透明，可呈轮状蔓延，边缘整齐或不整齐，部分菌落短时间内可蔓延长满整个平板。

从分离平板上选择 5 个分离良好的典型菌落，分别再次接种哥伦比亚血琼脂平板，35℃±1℃厌氧培养 48 h～72 h，获得纯培养物。

七、革兰染色镜检：确认梭状芽孢杆菌基本形态

挑取纯培养菌落，涂片进行革兰氏染色并镜检。梭状芽孢杆菌通常为革兰氏阳性杆菌，可形成芽孢，芽孢位置可为中生、近端生或端生，不同菌种芽孢是否膨大、菌体形态和排列方式也有差异。

需要注意，梭菌培养物在菌龄较老时可能出现革兰染色不稳定，部分细胞呈革兰阴性样表现。因此，应尽量使用新鲜纯培养物观察，并结合芽孢形态和后续分子或生化鉴定结果综合判断。

八、结果鉴定：生化、荧光PCR、质谱和16S rRNA测序

1. 生化鉴定

可使用微生物全自动生化鉴定系统，如 VITEK 2 ANC 鉴定卡，按说明书进行鉴定。原 SOP 提示，由于人工判读误差较大、正确率较低，不推荐使用 API 20A 或 Crystal Anaerobe ID 等商品化试剂条作为主要鉴定依据。

生化鉴定适合对常见厌氧菌进行初步种水平判断，但对近缘梭菌或肉毒梭菌相关菌群，单靠生化结果可能不足以完成最终确认。

2. 梭菌属荧光PCR检测

对革兰氏染色呈阳性的梭状芽孢杆菌纯培养物，可进行梭菌属荧光 PCR 检测。模板制备可挑取新鲜纯培养菌落约 20 个，悬浮于 1 mL 灭菌蒸馏水中，100℃煮沸 10 min，置冰或冰水浴快速冷却，10000 r/min 离心 2 min 后取上清备用。

每个反应总体积为 25 μL，包括 Probe Master Mix、上下游引物、探针、无菌水和模板 DNA。反应条件为：95℃ 10 min；随后 95℃ 20 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共 45 个循环。

结果判定时，空白对照 Ct≥40、阴性对照 Ct≥40、阳性对照 Ct＜35 时，检测结果有效。若样品 Ct＜35，判定样品中含有梭状芽孢杆菌属；若样品 Ct≥40，判定不含梭状芽孢杆菌属；若 35≤Ct＜40，应重复实验，重复结果仍在该范围时，按不含梭状芽孢杆菌属判定。

荧光 PCR 属阳性后，应继续采用其他鉴定手段鉴定到种，也可使用经验证的商品化梭菌菌种鉴定试剂盒。

3. MALDI-TOF MS 质谱鉴定

可使用飞行时间质谱对革兰氏染色阳性的纯培养物进行鉴定。质谱鉴定速度快、操作相对简便，但数据库质量和菌株覆盖范围会影响结果。原 SOP 特别提示：飞行时间质谱无法可靠鉴定肉毒梭菌，因此疑似肉毒梭菌仍需毒素基因检测或动物实验等方法确认。

4. 16S rRNA 测序

16S rRNA 测序可用于多数细菌的种属鉴定。操作流程包括 DNA 提取、通用引物 FD1/RP2 扩增约 1500 bp 片段、凝胶回收、必要时克隆测序、序列比对等。

但 16S rRNA 对部分近缘梭菌分辨率不足。尤其是生孢梭菌与 A 型、B 型肉毒梭菌 16S rRNA 序列同源性可超过 99%，因此 16S rRNA 测序不能准确区分生孢梭菌和某些肉毒梭菌类型。对疑似肉毒梭菌，仍需检测肉毒毒素基因或进行毒素确认。

九、肉毒梭菌鉴定：必须关注毒素基因或毒素

疑似肉毒梭菌的菌株不能仅靠形态、生化或 16S rRNA 测序定论，应检测肉毒毒素基因，必要时按照 GB 4789.12 方法进行动物实验或毒素确认。

1. 肉毒毒素基因PCR检测

按革兰氏阳性菌 DNA 提取试剂盒要求提取 DNA，使用针对 A、B、E、F 型肉毒毒素基因设计的引物进行 PCR 扩增。典型扩增片段大小为：

PCR 体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阴性对照和空白对照均无条带，阳性对照出现预期条带，待测样品出现对应大小条带时，判定为 PCR 阳性。若任一对照异常，应重做实验并排查污染或扩增失败。

2. 动物实验或毒素确认

疑似肉毒梭菌还可按照 GB 4789.12—2016 国标方法进行肉毒毒素检测和鉴定。肉毒毒素检测涉及高风险毒素和动物实验，应由具备资质、伦理审批和生物安全条件的实验室开展。

需要强调的是，肉毒梭菌风险的核心在于肉毒毒素。仅分离到疑似菌株，并不等同于确认存在可致病毒素；毒素基因、毒素表达和毒性确认对风险判断至关重要。

十、菌株保存

梭状芽孢杆菌保存应根据保存时间选择不同方式。

保存前应确认菌株纯度和鉴定结果，保存后应定期复苏验证活性。肉毒梭菌或疑似产毒菌株保存应符合生物安全管理要求。

十一、结果判定与报告

依据生化鉴定、梭菌属荧光 PCR、质谱鉴定、16S rRNA 测序以及必要的肉毒毒素基因或毒素检测结果，对样品中梭状芽孢杆菌进行判定。

常规报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出梭状芽孢杆菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出梭状芽孢杆菌。若检测目的为肉毒梭菌或特定梭菌种，应进一步报告具体菌种和毒素基因或毒素检测结果。

需要注意，“检出梭状芽孢杆菌属”与“检出肉毒梭菌”不是同一概念；“检出肉毒毒素基因”与“检出肉毒毒素”也不完全等同。报告时应严格使用与检测证据一致的表述。

十二、常见问题与注意事项

第一，培养基煮沸除氧必须从管内培养基真正沸腾后开始计时 10 min～15 min，不能只按水浴开始时间计算。

第二，接种时应尽量靠近试管底部，避免产生气泡和剧烈搅动，减少氧气带入。

第三，培养期间不得打开厌氧罐或破坏厌氧环境。建议使用透明厌氧装置，便于观察培养物状态。

第四，厌氧装置内应放置厌氧指示剂，确认培养期间厌氧状态有效。

第五，液体石蜡可用于加强厌氧环境，但若厌氧装置密闭性良好，也可不加。若使用液体石蜡，取增菌液划线时应尽量避开石蜡层，建议用移液器缓慢吸出增菌液至另一无菌容器后再划线。

第六，庖肉培养基中的牛肉粒不宜过多。牛肉粒会吸收部分水分，过多可能导致可获取的增菌液不足。

第七，乙醇处理是为了富集芽孢菌，但处理时间和比例应严格控制，避免影响目标菌回收。

第八，16S rRNA 测序不能准确区分所有近缘梭菌，尤其不能可靠区分生孢梭菌与部分 A、B 型肉毒梭菌。

第九，疑似肉毒梭菌必须关注毒素基因或毒素确认，不能仅凭菌落形态、生化或普通 16S 结果报告。

第十，肉毒毒素相关操作风险高，应由具备资质和生物安全条件的实验室执行。

十三、小结

梭状芽孢杆菌检验是一项以厌氧增菌、芽孢筛选、分离纯化和多手段鉴定为核心的定性检测方法。该方法先以 GBS 对样品进行适度稀释和均质，再接种 CMM 和 TPGYT 进行厌氧增菌；经培养物检查后，用乙醇处理富集芽孢菌，再接种哥伦比亚血琼脂进行厌氧分离和纯化。纯培养物通过革兰染色、形态观察、生化鉴定、荧光 PCR、质谱或 16S rRNA 测序进一步确认。

对于疑似肉毒梭菌，普通属水平鉴定远远不够，必须进一步检测肉毒毒素基因或按 GB 4789.12 方法确认肉毒毒素。整个流程的关键在于厌氧条件稳定、培养基充分除氧、分离菌落纯化充分、鉴定方法选择合理，以及报告表述与检测证据一致。只有这样，才能保证食品中梭状芽孢杆菌，特别是产肉毒毒素相关菌株的检测结果准确可靠。