SN/T 3624—2013 出口食品中弓形菌检测方法解析：常规培养与PCR确认

弓形菌，英文为 Arcobacter，是一类与弯曲菌亲缘关系较近的革兰氏阴性细菌，常呈弯曲或螺旋形杆状，不形成芽孢。它最初常被认为是“耐氧性较强的弯曲菌样细菌”，与传统弯曲菌相比，弓形菌既可在微需氧条件下生长，也可在普通大气氧浓度下生长，因此在食品、动物源产品、水体和加工环境中具有一定检出风险。

SN/T 3624—2013《出口食品中弓形菌的检测方法》规定了食品中弓形菌的检验方法，适用于布氏弓形菌（Arcobacter butzleri）、嗜低温弓形菌（Arcobacter cryaerophilus）和斯氏弓形菌（Arcobacter skirrowii）的检测。该方法包括常规培养检测法和 PCR 检测法。常规法用于分离、培养和表型鉴定，PCR 法用于快速筛查和确认，两者结合可提高检测效率和结果可靠性。

一、弓形菌不是弓形虫：先明确检测对象

中文“弓形菌”容易与“弓形虫”混淆。弓形虫是寄生虫，学名 Toxoplasma gondii；而本标准中的弓形菌是细菌，学名为 Arcobacter。二者在分类、检测方法、培养条件和食品安全意义上完全不同。

弓形菌属于弯曲菌目相关类群，菌体多呈弯曲杆状、螺旋形或弧形，革兰氏阴性，不产芽孢。其最佳生长氧气浓度通常为微量氧气环境，即约 3%～10% 氧气，但与典型弯曲菌不同，弓形菌在正常大气氧浓度下也可生长。这一特点使其在分离培养时既类似弯曲菌，又有自身特征。

布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌被认为是食品和动物源样品中较受关注的种类。研究资料显示，弓形菌可见于畜禽产品、环境水样和食品加工环境中，部分菌种与人类肠炎、腹泻、菌血症等感染有关。

二、方法适用范围与生物安全要求

SN/T 3624—2013 适用于食品中弓形菌的检测，尤其适合出口食品风险监测、进出口食品安全控制和相关实验室研究。样品类型可包括一般食品样品、整禽样品、表面涂拭样品和水样。

实验室操作应符合 GB 19489《实验室 生物安全通用要求》、GB/T 27403《实验室质量控制规范 食品分子生物学检测》和 GB/T 27405《实验室质量控制规范 食品微生物检测》等要求。所有培养物、污染耗材和废弃物应按生物安全要求灭菌处理，PCR 检测还应注意分区操作，防止扩增产物污染。

三、主要设备与材料

除常规微生物实验室设备外，弓形菌检测还需要微需氧培养装置、不同温度培养箱、过滤装置、相差显微镜、离心机、PCR 仪和电泳成像系统等。

微需氧培养装置可采用三气培养箱、微需氧产气袋或其他经过验证的装置。若采用产气袋，应注意产气袋适配容器体积，确保微需氧环境稳定。

四、培养基和试剂的作用

本方法常用 JM 肉汤、JM 琼脂、弓形菌琼脂、布氏肉汤、布氏琼脂、氧化酶试剂、三糖铁琼脂、Hugh-Leifson 培养基、马尿酸钠水解试剂、吲哚乙酸酯纸片和 Mueller-Hinton 血琼脂等。

PCR 体系中常用 Tris-HCl、EDTA、SDS、氯化钠、Taq 聚合酶、dNTP、引物、琼脂糖和 TAE 电泳缓冲液。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水要求，以减少 PCR 抑制或污染风险。

五、第一法：常规培养检测

1. 样品处理

一般样品取 25 g 或 25 mL，加入 225 mL JM 肉汤中。可使用带滤网均质袋，以拍击式均质器均质 1 min～2 min；也可加入盛有 225 mL JM 肉汤的均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。均质后经滤网或无菌纱布过滤，将滤液用于培养。

整禽等样品可用 200 mL 0.1%蛋白胨水充分冲洗内外部，振荡 2 min～3 min，经无菌纱布过滤至离心管中，以 16000×g 离心15 min，弃上清后用 10 mL 0.1%蛋白胨水悬浮沉淀，吸取 3 mL 接种于 100 mL JM 肉汤中。

需表面涂拭检测的样品，可用无菌棉签涂布 50 cm²～100 cm² 表面，将棉签头剪入 100 mL JM 肉汤中培养。

水样检测时，取 4 L 水样经 0.45 μm 滤膜过滤。若水样经氯处理，过滤前每升水中加入 5 mL 1 mol/L 硫代硫酸钠溶液中和余氯。过滤后将滤膜浸没于 100 mL JM 肉汤中培养。

2. 增菌培养

样品处理后，置 30℃±1℃培养44h±4h。必要时测定增菌液 pH，并调整至 7.2±0.2。弓形菌对培养条件较敏感，pH 偏离可能影响恢复和增殖。

3. 分离培养

将增菌液划线接种于 JM 琼脂和 弓形菌琼脂平板，置 30℃±1℃培养24 h～48 h，分别观察 24 h 和 48 h 的菌落形态。

可疑菌落形态仅用于初筛，不能直接判定为弓形菌。需挑取可疑菌落进行纯培养和后续鉴定。

六、弓形菌的形态和生化鉴定

挑取 5 个或更多可疑菌落，接种至布氏琼脂平板，置 30℃±1℃培养24 h～48 h 后进行鉴定。鉴定项目包括革兰氏染色、动力观察、氧化酶试验、25℃微需氧生长、TSI、Hugh-Leifson 培养基、马尿酸钠水解、吲哚乙酸酯水解等。

弓形菌与弯曲菌形态相似，镜检时容易混淆。弓形菌可在大气氧条件下生长，而许多弯曲菌对氧更敏感，这是二者的重要差异之一。实际鉴定应结合菌落形态、生长条件、生化反应和必要的分子检测结果综合判断。

药物敏感性试验：可选择项目

可挑取菌落，在布氏肉汤中制备 0.5 McFarland 菌悬液，涂布于 Mueller-Hinton 血琼脂平板。涂布时应从不同角度至少涂布 3 次，静置 5 min 后去除多余液体，干燥后放置 30 μg 头孢金素药敏纸片，置 30℃±1℃微需氧条件下培养44h±4h。

若细菌紧贴纸片生长，说明对头孢金素有抗性，生长试验阳性；若纸片周围出现抑菌圈，则为敏感，生长试验阴性。多数弓形菌对 30 μg 头孢金素表现为生长试验阳性，但少数斯氏弓形菌可能为阴性。因此该试验只能作为辅助鉴别项目。

七、第一法结果报告

综合样品增菌、分离培养、形态观察、生化鉴定和必要的辅助试验结果，报告检样单位中 检出弓形菌 或 未检出弓形菌。

若需要区分布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌，应结合附录中种水平鉴别项目或 PCR 结果进行判定。单纯根据菌落形态不能完成种水平鉴定。

八、第二法：PCR检测

PCR 法可用于增菌液或可疑纯菌落的快速筛查和确认。其优点是速度快、灵敏度较高，适合出口食品批量筛查；但对于增菌液 PCR 阳性样品，仍应通过常规培养法进行确认。

1. 模板 DNA 制备

取 1 mL 增菌肉汤，以 8000 r/min 离心5 min，弃上清，加入 50 μL DNA 提取液，振荡混匀，置 98℃热处理5 min～10 min，再以 12000 r/min 离心5 min，取上清作为 PCR 模板。

若为可疑菌落，可直接加入 50 μL DNA 提取液，振荡混匀后按同样方式热处理和离心取上清。也可使用经验证的商品化 DNA 提取试剂盒制备模板。

2. DNA质量评估

提取 DNA 可用核酸蛋白分析仪测定。通常 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比值在 1.7～2.0 时，说明 DNA 纯度较适合 PCR 检测。若比值偏低，可能存在蛋白质、酚类或其他抑制物；若偏高，则可能存在 RNA 或其他干扰。

3. PCR反应体系与质控

PCR 反应总体积为 50 μL，包括 10×PCR 缓冲液、MgCl₂、引物、Taq 聚合酶、dNTP、模板和无菌水。每次 PCR 检测均应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照可使用布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌检测序列 DNA 或质粒；阴性对照使用非弓形菌标准菌株 DNA；空白对照用双蒸水替代模板。

PCR 质控非常重要。若阳性对照未扩增出预期条带，或阴性对照、空白对照出现目的条带，本次检测结果无效，应重新实验并排查污染、试剂失效或扩增体系异常。

4. 电泳检测

用 1×TAE 配制 1.8%～2.0%琼脂糖凝胶。可在凝胶温度降至 55℃～60℃时加入溴化乙锭至终浓度 0.5 μg/mL，也可电泳后染色。取 8 μL～15 μL PCR 产物与 2 μL 上样缓冲液混合后点样，并加入 DNA 分子量标记物作为参照。按 3 V/cm～5 V/cm 恒压电泳 20 min～60 min，用凝胶成像系统记录结果。

5. PCR结果判定

在阳性对照扩增出预期条带、阴性对照和空白对照均未扩增目的条带的条件下，若样品 PCR 扩增出 1202 bp 条带，同时扩增出 2061 bp、198 bp 或 395 bp 中任意一条或多条条带，可判断样品 PCR 产物为弓形菌阳性。其他情况判断为 PCR 阴性。

PCR 阳性说明样品中存在符合目标序列的弓形菌 DNA 信号，但标准要求对 PCR 阳性样品使用第一法进行确认。对于可疑纯菌落，也可用 PCR 法确认；必要时可对 PCR 扩增产物测序进一步确认。

九、第二法结果报告

若增菌液 PCR 结果为弓形菌阴性，可报告检验单位中 未检出弓形菌。若增菌液或可疑纯菌落 PCR 结果为阳性，应结合常规培养确认结果，报告检验单位中 检出或未检出弓形菌。

换句话说，增菌液 PCR 阳性不能完全替代培养确认；但 PCR 阴性在质控有效的前提下，可作为未检出的判断依据之一。正式报告应符合标准和实验室 SOP。

十、常见问题与注意事项

第一，弓形菌是 Arcobacter，不是弓形虫。文章、报告和产品资料中应避免把二者混淆。

第二，弓形菌与弯曲菌形态相似，但弓形菌耐氧性更强，检测时应结合生长条件、生化反应和 PCR 结果判断。

第三，水样过滤前若含余氯，应加入硫代硫酸钠中和，否则可能抑制目标菌，造成假阴性。

第四，增菌液 pH 应必要时调整至 7.2±0.2。pH 偏离会影响弓形菌恢复和增殖。

第五，可疑菌落应挑取 5 个或更多进行纯培养，避免漏检不同菌落类型。

第六，氧化酶试验应在 10 s 内判读，超时变色可能导致误判。

第七，马尿酸钠水解和吲哚乙酸酯水解都需要足够菌量，菌量不足可能造成假阴性。

第八，PCR 操作应严格分区，扩增前后区域分开，防止产物污染。

第九，PCR 阳性样品仍需常规培养确认，尤其是出口食品正式判定时，应按标准流程执行。

第十，若需要进一步确认种水平结果，可结合 PCR、测序或其他经验证的分子方法。

十一、小结

SN/T 3624—2013 规定了出口食品中弓形菌（Arcobacter）的检测方法，适用于布氏弓形菌、嗜低温弓形菌和斯氏弓形菌。常规检测法以 JM 肉汤增菌、JM 琼脂和弓形菌琼脂分离为基础，再通过形态观察、氧化酶、TSI、Hugh-Leifson、马尿酸钠水解、吲哚乙酸酯水解等项目进行鉴定。PCR 法则通过目标片段扩增快速筛查和确认，提高检测效率。

该方法的关键在于：正确区分弓形菌与弓形虫，规范样品处理和增菌培养，准确识别可疑菌落，并结合表型鉴定与 PCR 结果进行综合判定。对于出口食品检测而言，常规培养与 PCR 互相补充，能更好保障弓形菌检测结果的可靠性。