化妆品中金黄色葡萄球菌检验方法解析

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是化妆品微生物控制中的重要检验对象之一。该菌可来源于人员皮肤、鼻腔、生产环境、包装材料或原料污染。如果在化妆品中检出，通常提示生产卫生、人员操作、防腐体系或包装控制存在风险。对于眼部、口唇、儿童用化妆品以及破损皮肤可能接触的产品，金黄色葡萄球菌污染更应受到重视。

根据《化妆品安全技术规范》相关微生物检验方法，金黄色葡萄球菌检验通常采用“增菌—分离—纯化—染色镜检—甘露醇发酵试验—血浆凝固酶试验”的流程。该方法并不是仅凭平板菌落颜色判定，而是通过形态学、生化反应和血浆凝固酶结果综合确认。

一、金黄色葡萄球菌的基本特征

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，显微镜下常呈葡萄串状排列，无芽胞，通常无荚膜。其典型特征包括能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性。血浆凝固酶阳性是鉴别致病性葡萄球菌的重要依据之一。

在培养特征上，金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上可形成金黄色、圆形、不透明、表面光滑的菌落，部分菌株周围可见溶血圈；在 Baird-Parker 平板上常形成灰色至黑色、圆形、光滑、凸起、湿润菌落，周围可有混浊带及透明带。这些特征可作为可疑菌落筛选依据，但不能直接作为最终报告依据。

二、方法适用范围与检验思路

该方法适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检验。由于化妆品中可能含有防腐剂、表面活性剂、油脂、粉体、香精和色素等成分，样品中的微生物可能处于受损或受抑制状态，因此首先需要通过适宜培养基进行增菌恢复。

检验流程可概括为：

只有分离平板出现可疑菌落，并经镜检、生化和血浆凝固酶试验证实后，才可报告检出金黄色葡萄球菌。

三、主要培养基和试剂的作用

金黄色葡萄球菌检验涉及多种培养基和试剂，不同培养基承担不同功能。理解其作用，有助于减少误判和操作偏差。

其中，Baird-Parker 平板是金黄色葡萄球菌分离中非常重要的选择性培养基。亚碲酸钾被金黄色葡萄球菌还原后可使菌落呈灰黑至黑色，卵黄成分可显示卵黄反应，形成典型的混浊带和透明带。

四、培养基配方与关键成分说明

1. 营养肉汤

制法为加热溶解，调 pH 为 7.4，分装后 121℃高压灭菌 15 min。营养肉汤主要用于血浆凝固酶试验前制备待检菌培养物。

2. 7.5%氯化钠肉汤

7.5%氯化钠肉汤利用金黄色葡萄球菌较强耐盐性的特点，对部分背景菌具有抑制作用。若没有 SCDLP 液体培养基，可作为增菌培养基使用。但对于含防腐剂的化妆品，SCDLP 对中和抑菌成分更有优势。

3. Baird-Parker 平板

增菌剂由 30%卵黄盐水 50 mL 与除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10 mL 混合制成。基础培养基灭菌后，临用时加热融化并冷至 50℃，每 95 mL 加入预热至 50℃左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5 mL，摇匀后倾注平板。培养基应致密、不透明，制备后的平板按规定条件保存，使用前不宜长时间放置。

五、增菌步骤：恢复受损菌并提高检出率

操作时，取 1:10 稀释的检液 10 mL，接种到 90 mL SCDLP 液体培养基中，置 36℃±1℃培养 24 h±2 h。若无 SCDLP 液体培养基，也可使用 7.5%氯化钠肉汤。

SCDLP 培养基适用于化妆品样品，是因为化妆品常含防腐剂、表面活性剂和油性成分，这些物质可能抑制微生物生长。SCDLP 中的卵磷脂、吐温等成分可在一定程度上中和或减弱抑菌作用，使受损金黄色葡萄球菌更容易恢复生长。

增菌培养时间和温度应严格控制。培养不足可能导致目标菌数量低而漏检；培养过度则可能使背景菌过度增殖，增加后续分离难度。

六、分离与典型菌落观察

从增菌培养液中取 1～2 接种环，划线接种到 Baird-Parker 平板上。若无该培养基，也可划线接种到血琼脂平板上。平板置 36℃±1℃培养 48 h±2 h。

在 Baird-Parker 平板上，金黄色葡萄球菌典型菌落为圆形、光滑、凸起、湿润，颜色从灰色到黑色，边缘较浅，周围可见混浊带，外层有透明带。用接种针轻触菌落时，可有类似奶油或树胶样柔软感。偶尔可见类似黑色菌落但无混浊带和透明带，这类菌落不一定为金黄色葡萄球菌，应进一步鉴定。

在血琼脂平板上，金黄色葡萄球菌常形成金黄色、圆形、不透明、表面光滑菌落，周围可出现溶血圈。需要注意的是，菌落颜色和溶血并非绝对特征，部分菌株可能颜色较浅或溶血不明显，因此不能仅凭血平板形态下结论。

分离后应挑取单个可疑菌落，在血琼脂平板上分纯，置 36℃±1℃培养 24 h±2 h。后续镜检和生化试验应使用分纯后的菌落。

七、染色镜检：确认形态是否符合

挑取血琼脂平板上分纯后的菌落，制片并进行革兰氏染色。金黄色葡萄球菌应表现为革兰氏阳性球菌，常呈葡萄串状排列，无芽胞，无荚膜，菌体较小，直径约 0.5～1.0 μm。

镜检的意义在于排除明显不符合的菌株。如果镜下观察为革兰氏阴性杆菌、芽胞杆菌、真菌或混合菌形态，则说明可疑菌落不符合金黄色葡萄球菌特征，或纯化不充分，应重新分离纯化后再进行确认。

八、甘露醇发酵试验

取血琼脂平板上分纯后的菌落，接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入高度约 2～3 mm 的灭菌液体石蜡，置 36℃±1℃培养 24 h±2 h。金黄色葡萄球菌通常能发酵甘露醇产酸。

甘露醇发酵培养基中的麝香草酚蓝为 pH 指示剂。若细菌发酵甘露醇产酸，培养基颜色会发生相应变化。液体石蜡覆盖的作用，是减少氧气影响，为发酵反应提供更适宜条件。

该试验是重要确认步骤之一，但仍需与血浆凝固酶试验结合判断。因为部分其他葡萄球菌也可能出现某些相似反应，不能仅凭甘露醇发酵结果报告检出金黄色葡萄球菌。

九、血浆凝固酶试验：关键确认试验

血浆凝固酶试验是金黄色葡萄球菌确认中的关键项目。操作时，吸取 1:4 新鲜血浆 0.5 mL，置于灭菌小试管中，加入待检菌 24 h±2 h 营养肉汤培养物 0.5 mL，混匀后置 36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中培养。每半小时观察一次，6 h 内若出现凝块，即为阳性。

同时，应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。将已知血浆凝固酶阳性菌株、阴性菌株的营养肉汤培养物，以及营养肉汤培养基各 0.5 mL，分别加入无菌 1:4 血浆 0.5 mL，混匀后同条件观察。对照结果正常，待检菌结果才具有判定意义。

目前实验室也可使用商品化血浆凝固酶试剂，按说明书操作。商品化试剂具有批间质量稳定、操作简便、结果更易标准化等优点，但仍需做好阳性和阴性对照。

十、结果如何报告？

若分离平板上出现可疑菌落，经血琼脂平板分纯后，染色镜检证实为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性，则可报告被检样品中检出金黄色葡萄球菌。

如果可疑菌落形态符合，但镜检不符合，或甘露醇发酵阴性，或血浆凝固酶试验阴性，则不能报告检出金黄色葡萄球菌。若对照异常、纯化不充分或结果矛盾，应重新分离、纯化和复核。

十一、常见误区与注意事项

第一，不能只凭 Baird-Parker 平板黑色菌落报告阳性。黑色菌落只是可疑特征，必须进一步纯化和确认。

第二，血琼脂上的金黄色菌落并不一定是金黄色葡萄球菌。部分微球菌、其他葡萄球菌或环境菌也可能形成类似菌落。

第三，甘露醇发酵阳性不是最终确认依据。血浆凝固酶阳性才是关键确认特征之一。

第四，血浆凝固酶试验必须设置对照。没有阳性、阴性和空白对照，结果可靠性不足。

第五，化妆品样品含防腐剂时，应重视增菌和中和效果。若中和不充分，可能导致目标菌受抑制而漏检。

第六，Baird-Parker 平板应新鲜、状态良好。平板保存过久、过干或补充剂加入温度不当，都会影响典型菌落表现。

第七，分纯后的菌落才能用于镜检和生化确认。混合菌落会导致镜检混乱和试验结果不稳定。

十二、小结

化妆品中金黄色葡萄球菌检验是一项以定性确认为主的微生物检测方法。其基本流程为：取 1:10 检液接种 SCDLP 液体培养基增菌，经 Baird-Parker 平板或血琼脂平板分离，挑取可疑菌落在血琼脂平板上分纯，再进行革兰氏染色、甘露醇发酵试验和血浆凝固酶试验。

金黄色葡萄球菌典型特征为革兰氏阳性葡萄状球菌、无芽胞、通常无荚膜，可发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶阳性。在 Baird-Parker 平板上常形成灰黑色至黑色菌落，并伴随混浊带和透明带；在血琼脂平板上可形成金黄色、圆形、光滑菌落，部分有溶血圈。

对于化妆品微生物检验而言，可靠结果来自规范的增菌、正确的选择性分离、充分纯化和完整确认。任何单一培养特征都不能替代最终鉴定流程。规范使用 SCDLP、Baird-Parker 平板、血琼脂平板和血浆凝固酶试验，是保证金黄色葡萄球菌检验准确性的关键。