产朊假丝酵母菌检验标准操作程序解析：平板计数、形态鉴定与结果报告

产朊假丝酵母，常用学名为 Candida utilis，是一类具有应用价值的功能性酵母菌，常见于生物产品、饲料添加剂、发酵制品和微生物制剂中。由于其可利用多种碳源和氮源生长，并具有一定蛋白质生产能力，因此在功能性微生物产品质量控制中，需要对其进行定性确认和定量计数。

依据 GB/T 34224—2017《生物产品中功能性微生物检测》，产朊假丝酵母菌检验通常采用“样品制备—系列稀释—孟加拉红琼脂平板培养—特征菌落计数—纯培养—形态学鉴定—生化鉴定—结果计算与报告”的流程。该方法的重点不只是数出平板上的酵母样菌落，还要通过后续鉴定确认这些菌落是否真正属于产朊假丝酵母菌。

一、方法原理与检测思路

产朊假丝酵母菌检验既可以用于定性判断，也可以用于定量计数。定性检测回答的是“25 g 或 25 mL 样品中是否检出产朊假丝酵母菌”；定量检测则用于评估样品中目标菌的数量，通常以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。

由于孟加拉红琼脂平板上可能同时生长其他酵母、霉菌或非目标微生物，仅凭红色、平滑、边缘整齐的菌落形态不能直接判定为产朊假丝酵母菌。因此，本方法采用“先计数特征菌落，再挑取部分菌落鉴定，根据确认比例换算目标菌数量”的思路。这样既能提高检测效率，又能减少误把相似酵母菌落计入目标菌的风险。

二、主要设备与材料

除常规微生物实验室灭菌、培养和无菌操作设备外，产朊假丝酵母菌检验还需要恒温培养箱、冰箱、天平、均质器、振荡器、无菌吸管或移液器、无菌锥形瓶、无菌培养皿、显微镜以及 pH 检测工具。

需要注意的是，产朊假丝酵母为酵母类真菌，常规平板培养一般按普通需氧条件进行。除非具体方法另有明确要求，不应将该检测写作厌氧培养。

三、培养基和试剂的作用

产朊假丝酵母菌检验常用孟加拉红琼脂培养基、麦芽汁液体培养基、无菌生理盐水和酵母菌生化鉴定试剂盒。

孟加拉红琼脂常用于真菌计数，红色染料可限制部分霉菌菌落扩散，使酵母样菌落更易计数。麦芽汁液体培养基则有利于酵母恢复生长，获得足够菌体用于镜检和生化鉴定。

四、样品制备：获得均匀的 1:10 样品匀液

固体和半固体样品取 25 g，置于含 225 mL 无菌生理盐水 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；也可置于含 225 mL 无菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。

液体样品应先充分摇匀，再用无菌吸管吸取 25 mL，加入装有 225 mL 无菌生理盐水 的无菌锥形瓶中。锥形瓶内可预置适量无菌玻璃珠，通过充分振摇制成 1:10 样品匀液。

样品制备的关键是“均匀”。功能性微生物产品中目标菌可能分布不均，尤其是粉末、颗粒、膏状和半固体样品。如果均质不充分，容易造成平行平板差异大，影响计数准确性。

五、系列稀释：每递增一次稀释都要更换吸管

用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 无菌生理盐水 的无菌试管中。操作时吸管尖端不要触及稀释液面，以减少交叉污染和挂液误差。随后振摇试管，或换用一支无菌吸管反复吹打混匀，制成 1:100 样品匀液。

再取新的 1 mL 无菌吸管或移液器吸头，按相同方法继续进行 10 倍递增稀释。每递增一次稀释，都应更换一次无菌吸管或吸头，避免高浓度样品带入低浓度稀释液，造成计数偏高。

稀释度应根据样品中目标菌含量预估选择。若是高活菌产品，应做到更高稀释度；若目标菌含量较低，则应保留较低稀释度平板，保证有可计数菌落。

六、平板接种与培养

根据待检样品菌含量估计，选择 2～3 个连续适宜稀释度。每个稀释度吸取 0.2 mL 样品匀液，接种于孟加拉红琼脂平板表面，用无菌涂布棒小心、快速、均匀地将接种液涂布于琼脂表面。涂布棒不得接触平皿边缘，每个稀释度接种 2 个平板。

涂布后，将平板静置约 10 min，使接种液完全被培养基吸收。随后翻转平皿，置 28℃±1℃培养 72h±2h。培养条件应保持稳定，避免培养箱频繁开门或温度波动。

涂布平板时，若接种液没有完全吸收就翻转培养，可能导致菌液流动，形成拖尾或融合菌落；若涂布不均，会造成菌落分布不均，影响计数。平板表面过湿或过干，也会影响菌落形成和典型性。

七、特征菌落计数

培养结束后，选择特征菌落数在 10 CFU～150 CFU 范围内、且无蔓延菌落生长的平板进行计数。低于 10 CFU 的平板记录具体菌落数；大于 150 CFU 的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若同一稀释度中一个平板出现较大片状菌落，该平板不宜采用，可用无片状菌落的平板作为该稀释度菌落数。若片状菌落不到平板面积的一半，而其余一半中菌落分布均匀，可计算半个平板后乘以 2，代表该平板菌落数，但应在记录中注明。

产朊假丝酵母菌在孟加拉红琼脂平板上的可疑特征菌落一般为 红色、平滑、边缘齐整。但这些形态并非产朊假丝酵母所独有，其他酵母也可能形成相似菌落，因此必须进行后续鉴定。

八、菌落挑选、纯培养与鉴定

1. 菌落挑选和纯培养

从平板上挑选 5 个红色、平滑、边缘齐整的特征菌落，分别转入麦芽汁液体培养基中，于 28℃±1℃培养 24h～48h。培养后用于形态学和生化鉴定。

挑取多个菌落的目的，是提高确认结果的代表性。若只挑一个菌落，可能因非目标相似菌落导致误判；若平板上菌落形态复杂，应优先挑取不同典型程度的可疑菌落进行确认。

2. 形态学鉴定

取纯培养物进行革兰氏染色或湿片观察，并在显微镜下检查。产朊假丝酵母细胞常呈 球形或腊肠形，大小约为 3.5 μm～4.5 μm × 7.0 μm～13.0 μm，可多边芽殖，并能形成假菌丝或有隔菌丝。

形态学鉴定可帮助确认是否为酵母类真菌，并观察是否具有产朊假丝酵母的典型细胞形态和出芽方式。但仅凭形态不能完成最终鉴定，因为不同假丝酵母或相关酵母之间可能存在形态相似性。

3. 生化鉴定

使用酵母菌生化鉴定试剂盒进行确认。生化鉴定通常依据糖类同化、发酵反应、氮源利用或其他代谢特征判断酵母种类。若菌株的形态学特征和生化鉴定结果均符合产朊假丝酵母菌特征，可判定为产朊假丝酵母菌。

若形态和生化结果不一致，应重新纯化后复测，必要时可结合分子鉴定或质谱鉴定进行确认。

九、目标菌数量如何计算？

由于特征菌落并不一定全部为产朊假丝酵母菌，需要先根据挑取鉴定结果换算每块平板上的目标菌数量。计算公式为：

a = b / A × C

其中，a 为每块平板上的产朊假丝酵母菌菌落数；b 为挑取后经证实为产朊假丝酵母菌的菌落数；A 为挑取平板上用于验证的菌落数；C 为平板上的所有特征菌落数。

例如，某平板上共有 100 个特征菌落，挑取 5 个进行鉴定，其中 4 个确认为产朊假丝酵母菌，则该平板目标菌菌落数为：

a = 4 / 5 × 100 = 80 CFU

若只有一个稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中产朊假丝酵母菌菌落数的平均值，再根据稀释倍数和接种体积换算为每克或每毫升样品中的菌落总数。

若两个连续稀释度的平板菌落数均在适宜计数范围内，可按加权公式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；ΣC 为纳入计算平板的产朊假丝酵母菌菌落数之和；n₁ 为第一稀释度，即低稀释倍数平板个数；n₂ 为第二稀释度，即高稀释倍数平板个数；d 为第一稀释度稀释因子。

需要特别注意，本方法每皿涂布量为 0.2 mL。若实验室按 CFU/g 或 CFU/mL 换算，应在 SOP 中明确是否需要将接种体积纳入计算，避免只乘稀释倍数而漏掉 0.2 mL 的体积校正。

十、结果判定与报告

若样品菌落符合产朊假丝酵母菌形态学及生化鉴定特征，可判定为产朊假丝酵母菌。

定性报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出产朊假丝酵母菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出产朊假丝酵母菌。

定量报告时，菌落数小于 100 CFU 时，以整数报告；菌落数大于或等于 100 CFU 时，对第 3 位数字进行修约后保留前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式表示，并采用两位有效数字。例如 12600 CFU/g 可报告为 1.3×10⁴ CFU/g。

十一、常见问题与注意事项

第一，培养条件不宜写作厌氧培养。产朊假丝酵母菌常规检测通常采用普通培养条件，28℃±1℃培养 72h±2h。

第二，特征菌落必须经过鉴定确认。红色、平滑、边缘整齐只是可疑特征，不能直接作为产朊假丝酵母菌计数结果。

第三，0.2 mL 涂布量会影响最终换算。结果计算时应结合稀释倍数和接种体积，实验室 SOP 中应明确换算规则。

第四，样品必须充分均质。固体、半固体和高黏度样品若分散不充分，会导致目标菌分布不均。

第五，每次递增稀释应更换吸管或吸头，防止交叉带菌。

第六，孟加拉红琼脂可限制霉菌蔓延，但不能完全防止所有蔓延菌落。若出现大片蔓延，应按计数规则处理。

第七，麦芽汁液体培养基应保证无菌和促生长能力。纯培养不充分会影响形态观察和生化鉴定。

第八，生化鉴定试剂盒应在有效期内使用，并按说明书判读。必要时设置阳性和阴性对照。

十二、小结

产朊假丝酵母菌检验是功能性微生物产品质量控制的重要项目。该方法以无菌生理盐水制备样品匀液，经系列稀释后取 0.2 mL 涂布于孟加拉红琼脂平板，在 28℃±1℃培养 72h±2h，选择 10 CFU～150 CFU 的特征菌落平板进行计数，并挑取典型菌落进行麦芽汁液体培养、形态学鉴定和生化鉴定。

该方法的关键是：样品制备充分、稀释准确、涂布均匀、培养条件正确、特征菌落经确认后再换算目标菌数量。对于生物产品中的功能性酵母检测而言，单纯计数不够，必须将菌落形态、显微形态和生化鉴定结合起来，才能保证产朊假丝酵母菌检测结果准确可靠。