嗜酸乳杆菌检验标准操作程序解析：MRS平板计数、厌氧培养与鉴定要点

嗜酸乳杆菌，学名 Lactobacillus acidophilus，是一类常见的乳酸菌，常用于益生菌制剂、发酵食品、微生态制剂、饲料添加剂和相关生物产品中。它能够发酵糖类产生乳酸，通常耐酸性较强，对营养条件和培养环境也有一定要求。因此，在功能性微生物产品质量控制中，嗜酸乳杆菌检验不仅要计数，还要确认平板上的可疑菌落是否真正属于目标菌。

依据 GB/T 34224—2017《生物产品中功能性微生物检测》，嗜酸乳杆菌检验通常采用“样品制备—系列稀释—MRS琼脂平板涂布培养—特征菌落计数—MRS肉汤纯培养—革兰染色镜检—生化鉴定—结果计算与报告”的流程。该方法的核心是利用 MRS 培养基支持乳杆菌生长，并在厌氧条件下培养，再通过形态学和生化鉴定确认目标菌。

一、方法原理与检测思路

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，为革兰氏阳性、无芽孢杆菌，常呈单个、成对或成链状排列。乳杆菌对普通营养培养基的适应性不如许多杂菌，因此检测时常使用 MRS 培养基。MRS 培养基含有蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、葡萄糖、吐温80、乙酸盐、柠檬酸盐以及镁盐、锰盐等，能够为乳酸菌提供较丰富的营养和适宜生长环境。

本方法采用平板涂布计数。由于 MRS 平板上可能生长其他乳酸菌或耐酸菌，仅凭菌落形态不能直接判定为嗜酸乳杆菌。因此，需要挑取特征菌落进行纯培养、革兰染色镜检和生化鉴定，再根据确认比例换算样品中的目标菌数量。

二、主要设备与材料

除微生物实验室常规灭菌、接种和培养设备外，本方法还需要恒温厌氧培养箱、冰箱、天平、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器、无菌锥形瓶、无菌培养皿、显微镜和 pH 检测工具。

嗜酸乳杆菌通常适合在低氧或厌氧条件下培养。若实验室采用厌氧罐、厌氧袋或其他厌氧系统替代恒温厌氧培养箱，应通过方法适用性确认，保证目标菌回收率和菌落典型性符合要求。

三、培养基和试剂的作用

嗜酸乳杆菌检验主要使用 MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、无菌生理盐水、革兰氏染色液和细菌生化鉴定试剂盒。

MRS 培养基是乳酸菌检测中最常用的培养基之一，但并非嗜酸乳杆菌专属选择性培养基。植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及其他乳酸菌也可能在 MRS 上生长，因此后续鉴定不可省略。

四、样品制备：制备均匀的 1:10 样品匀液

固体和半固体样品取 25 g，置于含 225 mL 无菌生理盐水 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；也可置于含 225 mL 无菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。

液体样品应先充分摇匀，再用无菌吸管吸取 25 mL，加入装有 225 mL 无菌生理盐水 的无菌锥形瓶中。锥形瓶内可预置适量无菌玻璃珠，充分振摇后制成 1:10 样品匀液。

样品制备的关键是充分均质。嗜酸乳杆菌产品常见形式包括冻干粉、颗粒、胶囊内容物、混合粉剂或液体制剂，菌体可能与载体、保护剂、蛋白粉或糖类成分混合不均。若样品分散不足，会造成平板间差异大，影响计数准确性。

五、系列稀释：逐级递增并更换吸管

用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 无菌生理盐水 的无菌试管中。操作时吸管尖端不要触及稀释液面，随后振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打混匀，制成 1:100 样品匀液。

继续进行 10 倍递增稀释时，每递增一次稀释，都应更换新的无菌吸管或吸头，防止高浓度样品带入低浓度稀释液，造成计数偏高。稀释度应根据样品标示活菌数或预估菌量选择，一般选择 2～3 个连续适宜稀释度用于接种。

六、平板接种与厌氧培养

根据待检样品菌含量估计，选择 2～3 个连续适宜稀释度。每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液，接种于 MRS琼脂平板表面，用无菌涂布棒小心、快速、均匀地涂布于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种 2 个平板。

涂布后，将平板静置约 10 min，使接种物完全被培养基吸收。随后翻转平皿，置 37℃±1℃厌氧培养箱中培养 48h±2h。

MRS 平板表面状态会影响涂布效果。平板过湿时接种液容易流动，导致菌落融合；平板过干时可能影响受损菌恢复。厌氧培养时应确认厌氧系统有效，若厌氧条件不足，部分乳杆菌生长可能减弱，导致计数偏低。

七、特征菌落计数

培养结束后，选择特征菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、且无蔓延菌落生长的平板进行计数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数；大于 300 CFU 的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若其中一个平板出现较大片状菌落，该平板不宜采用，可用同一稀释度中无片状菌落的平板作为该稀释度菌落数。若片状菌落不到平板面积的一半，而其余一半中菌落分布均匀，可计算半个平板后乘以 2，代表该平板菌落数，并在原始记录中注明。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，可将每条单链作为一个菌落计数。嗜酸乳杆菌在 MRS 平板上的可疑特征菌落通常为 凸起、表面粗糙、边缘卷曲，但这些特征并非该菌独有，仍需后续鉴定确认。

八、菌落挑选、纯培养与鉴定

1. 菌落挑选和纯培养

从平板上挑选 5 个凸起、表面粗糙、边缘卷曲的可疑菌落，分别转入 MRS肉汤培养基中，于 37℃±1℃厌氧培养 24h±2h，随后进行形态学和生化鉴定。

挑取多个菌落有助于提高结果代表性。若平板上有不同类型的可疑菌落，应选择不同形态菌落分别确认，避免只挑取最典型菌落导致结果偏差。

2. 形态学鉴定

取纯培养物进行革兰氏染色并镜检。嗜酸乳杆菌应为 革兰氏阳性杆菌，呈杆状，两端圆，长度约 0.9 μm～6.0 μm，可单个、成对或成链状排列，无鞭毛，无芽孢。

需要注意，乳杆菌属内不同种的细胞形态可能相似，仅凭显微镜不能可靠区分嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌或其他乳杆菌。因此，形态学鉴定只能作为初步确认，最终仍需结合生化鉴定或其他可靠方法。

3. 生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行确认。嗜酸乳杆菌与乳杆菌属其他常见菌种的鉴别通常依赖糖类发酵、酶反应、生长特性等组合结果。若形态学和生化鉴定结果均符合嗜酸乳杆菌特征，可判定为嗜酸乳杆菌。

若结果不一致，应重新纯化后复测。对于菌种准确性要求较高的产品，可结合 MALDI-TOF MS、16S rRNA 测序或更高分辨率的分子方法进行复核。

九、目标菌数量如何计算？

由于平板上的特征菌落不一定全部为嗜酸乳杆菌，需要根据挑取鉴定结果计算每块平板中的目标菌数量。计算公式为：

a = b / A × C

其中，a 为每块平板上的嗜酸乳杆菌菌落数；b 为挑取后经证实为嗜酸乳杆菌的菌落数；A 为挑取平板上用于验证的菌落数；C 为平板上的所有特征菌落数。

例如，某平板上共有 120 个特征菌落，挑取 5 个进行鉴定，其中 4 个确认为嗜酸乳杆菌，则该平板目标菌数量为：

a = 4 / 5 × 120 = 96 CFU

若只有一个稀释度平板菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中嗜酸乳杆菌菌落数的平均值，再根据稀释倍数和接种体积换算为每克或每毫升样品中的菌落总数。

若两个连续稀释度平板菌落数均在适宜计数范围内，应按加权公式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；ΣC 为纳入计算平板的嗜酸乳杆菌菌落数之和；n₁ 为第一稀释度，即低稀释倍数平板个数；n₂ 为第二稀释度，即高稀释倍数平板个数；d 为第一稀释度稀释因子。

需要特别注意，本方法每皿涂布量为 0.1 mL。若公式中的 d 未包含接种体积校正，实验室在换算 CFU/g 或 CFU/mL 时应明确加入相应体积校正系数，避免低估结果。

十、结果判定与报告

若样品菌落符合嗜酸乳杆菌形态学及生化鉴定特征，可判定为嗜酸乳杆菌。

定性报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出嗜酸乳杆菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出嗜酸乳杆菌。

定量报告时，菌落数小于 100 CFU 时，以整数报告；菌落数大于或等于 100 CFU 时，对第 3 位数字进行修约后保留前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式表示，采用两位有效数字。例如 12600 CFU/g 可报告为 1.3×10⁴ CFU/g。

十一、常见问题与注意事项

第一，MRS 平板上的可疑菌落不能直接报告为嗜酸乳杆菌，必须经过形态学和生化鉴定确认。

第二，本法每皿涂布量为 0.1 mL，最终结果换算时应考虑接种体积，否则可能低估样品菌数。

第三，加权公式应清楚写作 N=ΣC/[(n₁+0.1n₂)×d]，避免因括号和乘除关系不明导致计算错误。

第四，厌氧条件对乳杆菌生长很重要。厌氧系统失效或氧暴露过多，可能导致菌落数偏低或菌落形态不典型。

第五，样品必须充分均质。冻干粉、颗粒、胶囊内容物等样品若分散不充分，会导致平行结果差异大。

第六，每次递增稀释应更换无菌吸管或吸头，避免交叉带菌。

第七，乳杆菌属内菌种形态相似，不能仅靠显微镜区分，应结合生化鉴定或更高分辨率方法。

第八，MRS 培养基应进行质量控制。培养基 pH、营养状态、灭菌条件和厌氧培养环境都会影响嗜酸乳杆菌回收率。

十二、小结

嗜酸乳杆菌检验是功能性微生物产品质量控制中的重要项目。该方法以无菌生理盐水制备 1:10 样品匀液，经系列稀释后取 0.1 mL 涂布于 MRS琼脂平板，在 37℃±1℃厌氧培养48h±2h，选择 30 CFU～300 CFU 的特征菌落平板进行计数，并挑取可疑菌落进行 MRS肉汤纯培养、革兰染色镜检和生化鉴定。

该方法的关键在于：样品制备充分、稀释准确、涂布均匀、厌氧培养条件有效、特征菌落经鉴定确认后再换算目标菌数量。对于嗜酸乳杆菌这类功能性乳酸菌检测而言，单纯依靠菌落形态并不可靠，必须结合显微形态、生化鉴定和必要的复核方法，才能保证检测结果准确可信。