细菌回复突变试验仪器和试剂（二）：阳性诱变剂与S9代谢活化系统

细菌回复突变试验，又称Ames试验，是评价受试物是否具有诱发点突变潜力的经典体外方法。由于许多化学物质进入机体后需要经过肝脏代谢才表现出诱变性，因此试验中常设置“加S9”和“不加S9”两种条件。S9代谢活化系统可以在一定程度上模拟哺乳动物体内的肝脏代谢过程，是Ames试验中非常关键的试剂体系。

GB 15193.4-2014《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》中，对阳性诱变剂配制、S9辅助因子、肝S9组分制备和10% S9混合液的配制均提出了要求。对于培养基生产企业和检测实验室而言，理解这些试剂的作用，有助于更好地控制Ames试验的质量。

一、阳性诱变剂：验证试验系统是否灵敏

阳性诱变剂是已知能够诱导试验菌株发生回复突变的物质。设置阳性对照的目的，是证明本次试验使用的菌株、培养基、操作过程以及S9代谢活化系统均处于有效状态。若阳性对照不能产生预期回变菌落增加，则本次试验即使受试物结果为阴性，也不能直接判定受试物无致突变作用。

阳性诱变剂应根据所用菌株、是否加入S9以及试验方法选择。对于不加S9条件，常选择能直接诱变的阳性物；对于加S9条件，则应选择需要代谢活化后产生诱变作用的阳性物。阳性对照品配制时，应根据诱变剂性质和使用剂量选择合适溶媒，配制浓度、保存条件和使用期限都应记录清楚。

培养基成分和试剂除特殊说明外，至少应达到化学纯要求，并应确认无诱变性。含活性成分的培养基和试剂应避免重复高温处理，因为反复加热可能导致底物分解、营养成分变化或产生干扰性副产物。

二、S9代谢活化系统是什么？

S9组分是动物肝组织匀浆经9000 g离心后得到的上清部分，含有微粒体酶和胞质酶系统。Ames试验中使用的S9通常来自经酶诱导处理的大鼠肝脏，目的是增强细胞色素P450等代谢酶活性，使某些“间接诱变物”在体外被转化为具有诱变活性的代谢产物。

S9本身不能单独发挥完整作用，还需要加入镁钾离子、磷酸盐缓冲液、NADP和葡萄糖-6-磷酸等辅助因子，组成S9混合液。常用的10% S9混合液是指S9组分约占总体积的10%，一般由S9组分和辅助因子按1:9配制。

三、S9辅助因子的组成与作用

S9辅助因子为肝酶代谢反应提供离子环境、pH缓冲和还原力。若辅助因子配制错误，即使S9组分本身活性正常，也可能无法有效活化阳性诱变剂。

NADP和葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液通常要求无菌条件下现用现配，以减少降解和污染风险。磷酸盐缓冲液可通过高压灭菌或过滤除菌处理，但应避免pH偏移。

四、肝S9组分的诱导与制备思路

原标准资料中提到，可用Aroclor 1254诱导大鼠肝药物代谢酶，也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导。Aroclor 1254属于多氯联苯混合物，历史上常用于诱导S9，但由于其环境持久性和毒性风险，现代实验室应严格遵守危险化学品和动物实验伦理要求，并优先考虑法规允许、经验证的替代诱导体系或商品化S9。

苯巴比妥钠/β-萘黄酮联合诱导是较常用的替代方式，可诱导多种药物代谢酶。无论采用哪种诱导方式，最终S9组分都必须经过质量验证，包括无菌检查、蛋白含量测定和生物活性验证。

肝S9制备的核心步骤包括：选择健康成年大鼠；按规定诱导代谢酶；处死前禁食；取肝后用冰冷氯化钾溶液冲洗，减少血红蛋白对微粒体酶活性的抑制；在低温和无菌条件下匀浆；0～4℃条件下9000 g离心10 min；吸取上清液作为S9组分；分装、速冻，并置-80℃或更低温条件保存。

五、为什么S9制备必须低温、无菌、快速？

S9中的代谢酶对温度和污染非常敏感。高温或长时间暴露会使酶活下降，细菌污染则可能干扰后续Ames试验结果。制备过程中强调冰浴、低温离心、无菌器械和快速分装，都是为了保持S9的生物活性和稳定性。

S9制备后，应进行无菌检查和蛋白含量测定。原标准资料中建议每毫升蛋白含量不超过40 mg为宜。蛋白含量过低可能代谢活化能力不足，过高则可能增加体系毒性或干扰菌株生长。最终还应使用已知间接诱变剂进行活性验证，确认S9可以将其代谢活化并产生预期回变菌落增加。

六、10% S9混合液如何配制？

10% S9混合液通常临用前新鲜、无菌配制，并置冰浴中待用。原标准中给出了10 mL 10% S9混合液的典型配方。

该配方中S9组分占总体积的10%，因此称为10% S9混合液。不同受试物可能需要不同S9浓度，必要时也可配制30% S9混合液或调整每皿加入量。但任何调整都应经过方法验证，并在报告中说明。

常规情况下，每个平板可加入0.5 mL S9混合液。由于10% S9混合液中S9体积分数为10%，理论上每皿含S9组分约50 μL；若采用其他浓度或加入量，则应重新计算每皿实际S9体积。

七、S9混合液的性能验证

S9混合液配制后，应使用需要代谢活化的已知阳性诱变剂进行验证。若加S9阳性对照未出现预期阳性反应，可能说明S9酶活不足、辅助因子失效、保存过程反复冻融、配制比例错误或阳性诱变剂降解。此时不能继续使用该S9体系解释受试物阴性结果。

常见验证内容包括：S9批号、来源、诱导方式、蛋白含量、保存温度、冻融次数、无菌检查结果、阳性诱变剂反应强度以及与实验室历史范围的比较。每批S9都应建立完整记录，避免不同批次S9活性差异影响试验可比性。

八、试剂安全与废弃物管理

Ames试验中涉及的阳性诱变剂、Aroclor 1254、部分有机溶媒和受试物可能具有致突变、致癌、发育毒性或环境危害。实验室应在通风橱或符合要求的安全设施内称量和配制，操作人员应佩戴实验服、手套、护目镜等个人防护用品，避免吸入、皮肤接触和环境释放。

Aroclor 1254属于多氯联苯类物质，相关安全资料将多氯联苯列为具有致癌风险的物质类别。因此，若实验室仍使用该诱导剂，应严格按危险化学品和持久性有机污染物管理要求操作；更推荐采用经验证的替代诱导体系或购买质量受控的商品化S9。

含诱变剂废液、污染耗材、动物组织相关材料和含菌培养物，应按危险废物和生物污染物双重要求处理。不得将含诱变剂废液或PCB类物质直接排入下水道。

九、小结

细菌回复突变试验中的S9代谢活化系统，是发现间接诱变物的重要工具。S9混合液由肝S9组分、磷酸盐缓冲液、镁钾溶液、NADP和葡萄糖-6-磷酸钠盐等组成，能够在体外模拟部分哺乳动物肝脏代谢过程。其配制、保存和验证质量，直接影响Ames试验加S9条件下的结果可靠性。

对于实验室而言，S9体系的关键控制点包括：诱导方式合规、制备过程低温无菌、蛋白含量适宜、保存条件稳定、避免反复冻融、使用前新鲜配制混合液，并用已知间接诱变剂验证生物活性。对于培养基和试剂供应企业而言，若提供Ames试验相关试剂，应重点关注批间一致性、无诱变性、无菌性、稳定性和配套质控资料的完整性。